Genetic modification of Claviceps purpurea and ergot alkaloids production

Mgr. Helena HANOSOVÁ

Doctoral thesis

Genetic modification of Claviceps purpurea for increasing the content of ergot alkaloids

Abstract:

Presented thesis is focused on study of ergot alkaloids and on affecting of their production in Claviceps purpurea and is divided into three parts. The first part of the thesis is devoted to the literature review focused on biology of the Claviceps purpurea, genetics of ergot alkaloids production, their chemical structure and resulting biological activity. Methods of industrial production of ergot alkaloids, methods of genetic transformation of the Claviceps purpurea and possibilities for affecting of the ergot alkaloids production by means of molecular biology techniques are described. The second part of the thesis is focused on optimalization of the field production of ergot alkaloids by the gametocide application. Yield of sclerotia can be significantly reduced by presence of pollen contamination originating from imperfect male-sterile rye, as only unfertilized ovaria can be infected by spores of Claviceps purpurea. Application of suitable gametocide leads to significant improvement of rye male-sterility of both, a fertile rye variety and a variety with imperfectly induced cytoplasmic male sterility. Maleic hydrazide was proven to be a highly effective gametocide for both of the above-mentioned variety of rye and showed negligible effect on germination of C. purpurea spores. Both accurate dosaging of the active gametocidal compound and timing of the application just 23 weeks before onset of anthesis proved crucial to achieving high ergot yield with minimum grain impurities. The third part of the thesis is focused on genetic background of the production of ergopeptides in industrial strains of C. purpurea. Optimized method for transformation of C. purpurea was introduced at the department of Molecular Biology, Centre of region Haná with kind help of Prof. Tudzynski´s group and provides large number of transformants per transformation. The method was used for generation of two independent LpsA2 knock-out mutants, selected from total of 230 transformants. Chemical analysis of the knock-out mutants showed degeneration of the strain, resulting in loss of the ability to produce ergot alkaloids in the knockout mutants, as well as in the transformants with an ectopically integrated knockout cassette. Three genes of cluster for biosynthesis of ergot alkaloids (ie. dmaW, easC and easG) were selected as potential limiting steps of the pathway, determining the rate of the production of ergot alkaloids. Expression of selected genes under the control of strong, constitutive promoter gpdA didn´t lead to any biotechnologically significant, sustainable changes in EA production of tested strains. The LpsA1 gene, responsible for the production of ergotamine in the 20.1 strain, was constitutively expressed in the Gal 130 strain, the ergocristine producer. Two independent Gal 130 OE LpsA1, 20.1 transformants were analyzed for qualitative changes in their ergot alkaloid production. A significant improvement in ergotamine representation, which is originally the minor alkaloid of the strain, representing in WT only around 1% of the EA pool, was observed in both of the mutants.

Abstract:

Předkládaná disertační práce je zaměřená na studium a ovlivňování produkce námelových alkaloidů organismem Claviceps purpurea a sestává ze tří částí. V první části disertační práce je vypracována odborná rešerše, zabývající se biologií organismu Claviceps purpurea, genetickým podkladem produkce námelových alkaloidů, jejich chemickou strukturou a z ní vyplývající biologickou aktivitou. Jsou popsány metody průmyslové produkce námelových alkaloidů, metody genové transformace organismu C. purpurea a možnosti ovlivnění produkce metodami molekulární biologie. Druhá část disertační práce je zaměřená na optimalizaci polní produkce námelových alkaloidů aplikací vhodného gametocidu. Výnos sklerocií může být významně redukován pylem pocházejícím z nedokonale pylově sterilního žita, jelikož pouze neoplodněná ovaria mohou být sporami C. purpurea infikována. Aplikací vhodného gametocidu dojde k významnému zlepšení sterility žita s nedokonale navozenou cytoplasmatickou sterilitou či indukci sterility u fertilního žita. Maleinhydrazid prokázal vysokou míru gametocidního účinku u obou variant žita, přičemž měl zanedbatelný efekt na klíčení spor C. purpurea. Optimální čas aplikace (2-3 týdny před antézou) i optimální dávkování byly klíčové pro zisk vysokého množství sklerocií při minimálním znečištění zrnem. Třetí část disertační práce byla zaměřena na genetický podklad produkce ergopeptidů v průmyslových kmenech C. purpurea. Na Oddělení Molekulární biologie, Centra regionu Haná, Palackého university byla za laskavé pomoci skupiny Prof. Tudzynského zavedena optimalisovaná metoda transformace C. purpurea, zajišťující zisk velkého množství transformantů za transformaci. Metoda byla použita k přípravě dvou nezávislých LpsA2 knock-out mutantů vyselektovaných z množství 230 transformovaných kolonií. Chemická analýza knock-out mutantů stejně jako vzorků s náhodně integrovanou deleční kazetou prokázala degeneraci kmene a z ní vyplývající neschopnost produkce námelových alkaloidů. Tři geny klastru pro biosyntézu námelových alkaloidů (tj. dmaW, easC a easG) byly vybrány jako potenciální limitující kroky dráhy, určující míru produkce námelových alkaloidů. Jejich exprese pod silným konstitutivním promotorem gpdA nezapříčinila významné a udržitelné zvýšení produkce námelových alkaloidů v testovaných kmenech. Gen LpsA1, odpovědný za produkci ergotaminu v kmeni 20.1 byl konstitutivně exprimován v kmeni Gal 130, produkujícím ergokristin jako hlavní alkaloid. Dva nezávislí Gal 130 OE LpsA1, 20.1 transformanti byli testováni pro kvalitativní změny v produkci námelových alkaloidů. Bylo u nich zjištěno významné zvýšení relativního zastoupení ergotaminu, jež je ve WT kmeni Gal 130 produkován v míře přibližně 1% z celkového obsahu námelových alkaloidů.

Keywords

Claviceps purpurea, genová modifikace, námelové alkaloidy, overexprese genů klastru pro biosyntézu námelových alkaloidů, heterologní exprese LpsA genu, navození pylové sterility žita aplikací gametocidu

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 4. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 27. 6. 2018
• Supervisor: doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D., doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry