Vývoj imunologických testů pro detekci nebezpečných bakteriálních patogenů

Bc. Lada Šmídová

Master's thesis

Development of immunoassays for the detection of dangerous bacterial pathogens

Abstract:

Cílem diplomové práce bylo vytvořit imunologický test pro detekci nebezpečného bakteriálního patogenu methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA). Infekce MRSA způsobují celosvětové problémy ve zdravotnických zařízení poskytujících akutní a následnou péči v lůžkové i ambulantní části, proto je u pacientů velmi důležitá včasná a rychlá diagnostika a cílená terapie. Z E. coli byl pomocí QIAquick PCR Purificatin Kitu izolován bakteriální konstrukt, který byl následně purifikován a dialyzován. Získaný rekombinantní protein PBP2a byl v různých koncentracích nanesen na nitrocelulózovou membránu v podobě linií. Dále se provedla optimalizovaná blot-line metoda pro detekci specifických protilátek proti rekombinantnímu antigenu PBP2a ve třídách imunoglobulinů IgG, IgA a IgM. Pro detekci bylo použito několik různých koncentrací konjugátu Goat Anti-Human IgG-AP, Goat Anti-Human IgA-AP nebo Goat Anti-Human IgM-AP. Intenzita zabarvení linií každého jednotlivého stripu byla hodnocena pomocí Immunoblot softwaru. Z naměřených hodnot byla zjištěna diagnostická citlivost, specifita a celková diagnostická shoda. Dále bylo provedeno testování preciznosti za podmínek opakovatelnosti (intra-assay) a reprodukovatelnosti (inter-assay). Preciznost metody byla vyjádřena variačním koeficientem. Jako nejvhodnější pro výrobu soupravy IgG byla stanovena koncentrace antigenu PBP2a od 0,30 mg/ml do 0,45 mg/ml a koncentrace konjugátu IgG 1:1500-1:1800. Pro třídu imunoglobulinů IgA byla jako nejvhodnější zjištěna koncentrace antigenu PBP2a od 0,40 mg/ml do 0,52 mg/ml a koncentrace konjugátu IgA 1:500-1:1000. Variační koeficient za podmínek opakovatelnosti pro celý rozsah u třídy IgG je 10,09 % a u třídy IgA je 8,91 %. Variační koeficient za podmínek reprodukovatelnosti pro celý rozsah u třídy IgG je 9,23 % a u třídy IgA je 9,60 %. Preciznost metody za podmínek opakovatelnosti a reprodukovatelnosti pro třídy imunoglobulinů IgG a IgA vyhovuje kritériím pro výrobu diagnostické soupravy. Výsledky titrací prokázaly, že vyrobené konkrétní šarže karet nitrocelulózové membrány s naneseným antigenem PBP2a musí být vždy ověřeny na panelu referenčních vzorků a podle toho se nastaví hodnoty koncentrací (jak antigenu, tak konjugátu) dle potřeby, odlišně však pro třídu imunoglobulinů IgG a IgA.

Abstract:

The aim of the thesis was to develop an immunoassay for the detection of dangerous bacterial pathogen, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). MRSA infections cause global problems in health facilities which provide acute and follow-up care in inpatient and outpatient parts. That is why early and rapid diagnosis and targeted thereapies are very important for the subjects. E. coli was purified using the QIAquick PCR kit Purificatin isolated bacterial constructs, which were subsequently purified and dialyzed. The recombinant protein PBP2a in different concentrations was applied to a nitrocellulose membrane in the form of lines. Furthermore was performed optimized blot-line method for the detection of specific antibodies against the recombinant antigen PBP2a in the classes IgG, IgA and IgM. Several different concentrations of the conjugate Goat Anti-human IgG-AP, Goat Anti-human IgA-AP or Goat anti-Human IgM-AP were used for the detection. The color intensity of each line of the strip was evaluated with Immunoblot software. The measured values were used to determine diagnostic sensitivity, specificity and overall diagnostic match. Further testing of precision was carried out under repeatability conditions (intra-assay) and reproducibility (inter-assay). Precision of the method was expressed by coefficient of variation. As the most suitable for the manufacture of a IgG kit was determined the concentration of the antigen PBP2a from 0.30 mg/ml to 0.45 mg/ml and the concentration of IgG conjugate from 1:1500 to 1:1800. For class IgA as the most appropriate antigen was determined concentration PBP2a from 0.40 mg/ml to 0.52 mg/ml and conjugate concentrations of IgA from 1:500 to 1:1000. The coefficient of variation under repeatability conditions for the entire range of the IgG class is 10.09 %, and for IgA is 8.91 %. Variation coefficient reproducibility conditions for the entire range of the IgG class is 9.23 % and for IgA is 9.60 %. Precision of the method under conditions of repeatability and reproducibility for classes IgG and IgA meets the criteria for the manufacture of a diagnostic kit. Titration results showed that particular batch of cards made of nitrocellulose membrane coated with antigen PBP2a must always be verified on the panel of reference samples and the values of concentrations (for both antigen and conjugate) should be set according to the needs, but differently for the class of immunoglobulins IgG and IgA.

Keywords

opakovatelnost, reprodukovatelnost, Staphylococcus aureus, MRSA, blot, PBP2a, IgG, IgA, IgM, nitrocelulózová membrána, citlivost, specifita

Keywords

specificity, reproducibility, sensitivity, MRSA, blots, PBP2a, IgG, Staphylococcus aureus, IgA, IgM, nitrocellulose membrane, repeatability

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Pavlína Adam, Ph.D.

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / field:
Animal Breeding / Animal Biotechnology