Charakterizace lipidů v biologických vzorcích s využitím kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie

Ing. Magdaléna Ovčačíková

Doctoral thesis

Characterization of lipids In biological samples using liquid chromatography and mass spectrometry

Abstract:

Prvni .ast teto prace byla v.novana vyvoji nove metody komprehensivni dvoudimenzionalni kapalinove chromatografie (2D-LC) vyu.ivajici ionizaci elektrosprejem (ESI) s hmotnostni detekci ke komplexni lipidomicke charakterizaci vybranych biologickych vzork.. V prvni dimenzi (D1) byla vyu.ita ultra-vysokou.inna kapalinova chromatografie v systemech s obracenymi fazemi (RP-UHPLC) s kolonou obsahujici oktadecylsilikagelovou stacionarni fazi (150 mm x 1 mm, velikost .astic 1,7 ?Ęm). Tato metoda umo.nila separaci lipid. li.icich se svou hydrofobni .asti molekuly, zejmena pak delkou .et.zc. navazanych mastnych kyselin (FA) a po.tem a polohou dvojnych vazeb (DB). Pomoci chromatografie hydrofilnich interakci (HILIC) v druhe dimenzi (D2), bylo dosa.eno rozd.leni koeluujicich t.id lipid. na zaklad. jejich polarit. Pro HILIC separaci byla vyu.ita silikagelova kolona s povrchov. poreznimi .asticemi (50 mm x 3 mm, velikost .astic 2,7 ?Ęm). Reten.ni .asy z obou dimenzi, p.esne hodnoty m/z a tandemova hmotnostni spektra poskytla vysokou jistotu v ramci identifikace jednotlivych lipid.. Reten.ni chovani lipid. v RP-UHPLC se .idi podle pravidla tzv. ekvivalentniho po.tu uhlik. (ECN), co. poskytuje dal.i potvrzeni spravnosti identifikaci. Vysledkem komprehensivni 2D-LC/ESI-MS metody byla identifikace 143 druh. lipid. ze 4 kategorii a 10 t.id ve vzorcich lidske krevni plazmy a mozku prasete domaciho. Druha .ast teto prace byla v.novana optimalizaci nove RP-UHPLC/ESI-MS metody vyu.ivajici dv. seriov. zapojene kolony o celkove delce 30 cm s .asticemi o velikosti men.i ne. 2 ?Ęm za u.elem separace a identifikace velkeho po.tu lipid. v biologickych vzorcich. K detekci lipid. byl pou.it hybridni hmotnostni spektrometr s vysokym rozli.enim typu kvadrupol s analyzatorem doby letu (QTOF). K ionizaci byla vyu.ita ESI se zaznamem kladnych i zapornych iont.. Ve v.t.in. p.ipad. bylo dosa.eno p.esnosti ur.eni hmoty lep.i ne. 5 ppm, .eho. bylo vyu.ito p.i identifikaci jednotlivych lipid.. Celkov. bylo identifikovano vice ne. 400 lipid. z 14 polarnich a nepolarnich t.id lipid. z 5 kategorii. Jako vzorky byly pou.ity lidska krevni plazma, lidske erytrocyty, lidska mo. a mozkova tka. prasete domaciho. Dale byla tato prace zam..ena na studii reten.niho chovani lipid. v RP-UHPLC pomoci sestaveni obecnych zavislosti relativnich reten.nich .as. na relativnim po.tu uhlik. (CN) nebo na relativnim po.tu DB. Tyto zavislosti byly navr.eny na zaklad. polynomicke regrese druhého stupně. Pravidelné retenční chování v homologických sériích lipidů poskytuje další významný identifikační bod v lipidomické analýze využívající ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii ve spojení s hmotnostní spektrometrií (UHPLC/MS), což zvyšuje jistotu identifikace jednotlivých lipidů. Využitím údajů z dříve publikovaných prací v režimu kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi (RP-LC) a ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie (UHPSFC) byla dokázána obecná použitelnost polynomické závislosti pro popis retenčního chování a predikci retenčních časů. Poslední část této disertační práce byla zaměřena na shotgun MS kvantitativní analýzu vzorků nádorových a sousedních zdravých tkání, které byly získány od pacientů trpících histopatologicky potvrzeným nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC). Získaná data byla analyzována pomocí softwaru LipidQuant, díky kterému bylo ve vzorcích plic identifikováno celkem 314 lipidů. Získaná kvantitativní data byla dále vyhodnocena s využitím vícerozměrné statistické analýzy dat (MDA). Pro charakterizaci statisticky významných rozdílů identifikovaných lipidů v obou typech tkání byla využita nesupervizovaná analýza hlavních komponent (PCA) a supervizovaná ortogonální metoda nejmenších čtverců (OPLS). Pomocí metody OPLS bylo určeno 10 druhů lipidů se zvýšenou nebo sníženou koncentrací značících statisticky v

Abstract:

ýznamné rozdíly mezi nádorovou a zdravou tkání plic.

Abstract:

The first part of this thesis was aimed on the development of a new continuous comprehensive two-dimensional liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry method for the lipidomic characterization of complex biological samples. The reversed-phase ultrahigh-performance liquid chromatography with a C18 column (150 mm ?~ 1 mm, 1.7 ?Ęm) used in the first dimension made the separation of numerous lipid species differing in their hydrophobic part of the molecule, mainly fatty acyl chain lengths and the number and positions of double bonds, possible. Coeluted lipid species in the first dimension were resolved by the fast hydrophilic interaction liquid chromatography separation (50 mm ?~ 3 mm, 2.7 ?Ęm, core.shell particles) of lipid classes according to their different polarities in the second dimension. Retention times in both of dimensions, accurate m/z values, and tandem mass spectra provided high confidence in the identification of lipid species. The retention behavior of individual lipids in reversed-phase mode followed the equivalent carbon number pattern, which provides an additional tool for unambiguous identification. This analytical method was applied for the lipidomic characterization of total lipid extracts of human plasma and porcine brain samples, which resulted in the identification of 143 lipid species from four lipid categories and ten lipid classes. The second part of this thesis was aimed on the optimization of a new RP-UHPLC method using two 15 cm sub.2 ?Ęm particles octadecylsilica gel columns with the goal to separate and identify a large number of lipid species in biological samples. The identification was performed by the coupling with high-resolution tandem mass spectrometry (MS/MS) using QTOF instrument. ESI full scan and tandem mass spectra were measured in both polarity modes with the mass accuracy better than 5 ppm, which provided a high confidence of lipid identification. Over 400 lipid species covering 14 polar and nonpolar lipid classes from 5 lipid categories were identified in total lipid extracts of human plasma, human erythrocytes, human urine and porcine brain. The general dependences of relative retention times on CN or relative DB number were constructed and fitted with the second degree polynomial regression. The regular retention patterns in homologous lipid series provided additional identification point for UHPLC/MS lipidomic analysis, which increased the confidence of lipid identification. The reprocessing of previously published data by our and other groups measured in the RP mode and ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography on the silica column showed more generic applicability of the polynomial regression for the description of retention behavior and the prediction of retention times. The novelty of this work is the characterization of general trends in the retention behavior of lipids within logical series with constant fatty acyl length or double bond number, which may be used as an additional criterion to increase the confidence of lipid identification. The last part of this thesis was focused on a new quantitative shotgun MS analysis of tumors and surrounding normal tissues of patients suffering from NSCLC. Obtained data were analyzed using our new LipidQuant software. Over 300 lipid species were identified in all lung samples. The MDA methods using unsupervised PCA and supervised OPLS were used for the characterization of statistically significant differences in identified lipid species. Ten most significant up- and down-regulated lipids in OPLS score plots were determined. Key

Keywords

lipidy, lipidomika, kapalinová chromatografie hydrofilních interakcí, ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie v systémech s obrácenými fázemi, dvoudimenzionální kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, retenční chování, shotgun, rakovina plic

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 10. 2016

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 13. 10. 2016

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Doctoral programme / field:
Analytical Chemistry / Analytical Chemistry