Proximity-dependent biotinylation (BioID) of Leishmania mexicana dual specificity protein/lipid phosphatase LmDUSP1

Bc. Martina BYRTUSOVÁ

Diplomová práce

Abstract:

Phosphatases co-working with kinases are one of the key regulatory mechanisms controlling cellular processes by phosphorylation/dephosphorylation. Pathogens can successfully use phosphatases as a weapon to help them survive, proliferate, and invade the host immune system. Leishmania mexicana is an obligate intracellular protozoan parasite that can cause cutaneous leishmaniasis. Recently potential new virulence factor of L. mexicana was identified as a dual specificity protein/lipid phosphatase (LmDUSP1). However, what are the biochemical pathways and how LmDUSP1 contributes to the parasite's survival within the mammalian host remains undercover. We applied the proximity-dependent biotinylation (BioID) technique to study LmDUSP1 protein environments. We generated two L. mexicana mutated cell lines using CRISPR-Cas9 genome editing technology with a promiscuous biotin ligase BirA* fused to LmDUSP1 on C - and N-terminus, demonstrated the enzymatic activity of ligase being a part of C-tag fusion protein and performed immunoprecipitation of biotinylated proteins in the proximity of LmDUSP1.

Abstract:

Fosfatázy spolupracují s kinázami a jsou jedním z klíčových regulačních mechanismů řídících buněčné procesy fosforylace a defosforylace. Různé patogeny mohou využít fosfatáz jako zbraň k přežití, množení se a napadání hostitelského imunitního systému. Leishmania mexicana je obligátní intracelulární parazit, který vyvolá leishmaniózu způsobující široké spektrum klinických onemocnění. V předchozí práci Kraeva et al., 2019 identifikovali duální specifickou protein/lipid fosfatázu (LmDUSP1) a označili ji jako možný potenciální faktor virulence u trypanosomatidního parazita L. mexicana. Nicméně biochemické dráhy a schopnost kontribuce LmDUSP1 k přežití v hostitelské buňce je nezjištěna. Ke studiu LmDUSP1 v prostředí jsme využili techniku Proximity-dependent biotinylation (BioID). Vytvořili jsme 2 mutované linie L. mexicany s použitím technologie genetického upravování CRISPR-Cas9 spolu s promiskuitní biotin ligázou BirA* fúzovanou s LmDUSP1 na C- a N-konci. Ukázali jsme enzymatickou aktivitu ligázy, která byla součástí C-konce fúze s proteinem, a úspěšně jsme provedli imunoprecipitaci biotinylovaných proteinů v blízkosti LmDUSP1.

Keywords

Leishmania mexicana, LmDUSP1, BioID, CRISPR-Cas9, faktor virulence

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 4. 2024

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 5. 2024
• Vedoucí: Ing. Natalia Kraeva, Ph.D.

OSTRAVSKÁ UNIVERZITA

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Experimentální biologie