Vplyv črevného mikrobiómu na metabolizmus liečiv v experimentálných modeloch

Mgr. Nina ZEMANOVÁ

Doctoral thesis

Effect of Gut Microbiome on Drug Metabolism in Experimental Models

Abstract:

Predkladaná dizertačná práca sa zaoberá štúdiom vplyvu črevného mikrobiómu na metabolizmus liečiv a farmakokinetické parametre v experimentálnych modeloch myší. Prvá časť práce sa zaoberá úlohou črevného mikrobiómu a psychosociálneho stresu (akútneho a chronického) v expresii mRNA transkripčných faktorov a expresii mRNA a enzymatickej aktivite enzýmov I. fázy metabolizmu liečiv - cytochrómov P450 (CYP). Výsledky našej práce ukazujú, že stres zohráva dôležitú úlohu v expresii mRNA CYP, ale je to hlavne chronický stres, ktorý má signifikantný efekt na enzymatické aktivity spolu s črevným mikrobiómom. Medzi najviac ovplyvnené aktivity CYP patria CYP1A, CYP2C (aktivita stanovená pomocou diklofenaku) a CYP3A. U akútne stresovaných myší boli pozorované signifikantné zmeny mRNA hladín, avšak korešpondujúce enzymatické aktivity neboli ovplyvnené. Bol tak preukázaný vplyv črevného mikrobiómu spolu s chronickým psychosociálnym stresom na expresiu a aktivitu vybraných foriem CYP, čo môže potencionálne viesť k neúčinnému metabolizmu liečiv a vo výsledku môže mať tento stav nepriaznivý dopad na organizmus. Druhá časť práce bola zameraná na vývoj a validáciu metodiky využiteľnej na stanovenie antibakteriálneho a antiprotozoálneho liečiva metrodanizolu a jeho primárneho metabolitu 2-hydroxymetronidazolu. Ide o spoľahlivú, jednoduchú a rýchlu metódu s využitím vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC), ktorou sa dá simultánne stanoviť parentná látka, ako aj metabolit pri dvoch rôznych vlnových dĺžkach. Vyvinutá metóda je charakterizovaná vysokou presnosťou (RSD% < 6) a je použiteľná aj pre stanovenie v malých objemoch vzoriek plazmy, resp. séra (40 - 100 l). Tretia časť práce nadväzuje na vyvinutú metodiku, keďže bola využitá na stanovenie metronidazolu a 2-hydroxymetronidazolu vo vzorkách krvnej plazmy SPF a GF myší. Ukázalo sa, že absencia mikrobiómu (GF myši) signifikantne ovplyvňuje plazmatické koncentrácie metronidazolu, pretože bol sledovaný 30% nárast hladiny tohto liečiva v plazme GF myší. Naopak, rozdiel medzi hladinami 2-hydroxymetronidazolu u SPF a GF myší nebol tak výrazný. Posledná časť dizertačnej práce sa zaoberá vplyvom črevného mikrobiómu a liečiva metronidazolu (ktorého hladina v plazme myší bola stanovená v predchádzajúcej časti experimentov) na expresiu mRNA transkripčných faktorov zapojených v regulácii CYP, expresiu mRNA a enzymatickú aktivitu CYP. V štúdii bolo preukázané, že zmena v expresii transkripčných faktorov a niektorých CYP vykazuje rozdielny časový priebeh sledovaný vo vzorkách SPF a GF myši po podaní metronidazolu. Najvýznamnejšie bola ovplyvnená hladina mRNA Cyp2b10, ktorého expresia bola zvýšená u SPF i GF myší, avšak zvýšená enzymatická aktivita tohto enzýmu sa neprejavila len u GF myší. Výsledky naznačujú vplyv črevného mikrobiómu spolu s podaním liečiva na dráhy zapojené do regulácie CYP syntézy a do hepatálneho metabolizmu liečiv so zjavne relevantnými klinickými dôsledkami.

Abstract:

The aim of the presented dissertation work was to study the effect of gut microbiome on drug metabolism and pharmacokinetics parameters in experimental murine models. The first part of this work was focused on the role of gut microbiome along with psychosocial stress (acute and chronic) in the mRNA expression of transcription factors, and mRNA expression and enzyme activities of Phase I enzymes - cytochromes P450 (CYP). Our results showed that stress plays important role in CYP mRNA expression, but it is mainly the chronic stress, which significantly affects the enzymatic activities along with gut microbiome. The most affected CYP activities are CYP1A, CYP2C (determined with diclofenac) and CYP3A. In acute stressed mice, significant changes in mRNA expression were observed, however the corresponding activities were not affected. Our study suggests an important role of the gut microbiota along with chronic psychosocial stress in the expression and activity of CYPs, which can potentially lead to less effective drug metabolism and, as a result, a harmful impact on the organism The second part of this work was focused on the development and validation of a rapid, reliable and simple high-performance liquid chromatography (HPLC) method to determine metronidazole, antibacterial and antiprotozoal drug, along with its primary metabolite, 2-hydroxymetronidazole, in plasma or serum. Metronidazole and 2-hydroxymetronidazole were simultaneously detected at two different wavelenghts. The method is characterized by high precision (RSD% < 6) and can be used for determination in small amounts of plasma (40 - 100 l). The next part of the work follows up on the method described earlier, as we determined metronidazole and 2-hydroxymetronidazole in murine blood plasma in SPF and GF mice. It has been found that the absence of microbiota significantly affected plasma concentration of metronidazole, resulting in higher levels (by 30%) of the parent drug in murine plasma of GF mice. In contrast, the difference between the concentrations of 2-hydroxymetronidazole in SPF and GF mice was less pronounced. The last part of this work was focused to uncover the possible molecular changes leading to altered metronidazole metabolism in GF mice, the time course of the expression of transcription factors and CYPs has been determined after metronidazole administration in comparison with the control SPF mice. The mRNA expression of transcription factors (involved in the regulation of various CYPs) and some selected CYPs has shown a different time course in samples from SPF and GF mice after metronidazole administration. The most affected mRNA expression was the mRNA of Cyp2b10, as it was significantly increased in both SPF and GF mice. However, the enzymatic activity was increased only in SPF mice. The results presented here highlighted the effect of gut microbiota along with concomitantly taken medication on the pathways involved in the regulation of CYP synthesis and hepatic drug metabolism with apparently relevant clinical implications.

Keywords

cytochrom P450, mikrobiom, metabolismus léčiv, stres, metronidazol

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 12. 2021

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Eva Anzenbacherová, CSc.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Chemistry and Clinical Biochemistry / Medical Chemistry and Clinical Biochemistry