Cytotoxicita uhlíkových kvantových teček a jejich distribuce v mezenchymálních kmenových buňkách

Bc. Tomáš MALINA

Master's thesis

Cytotoxicity of carbon quantum dots and their distribution in mesenchymal stem cells

Abstract:

Tato diplomová práce je zaměřená na cytotoxicitu uhlíkových kvantových teček (CQDs) a jejich distribuci v lidských mezenchymálních kmenových buňkách (hMSC). V teoretické části jsou představeny kvantové tečky na bázi těžkých kovů (QDs) a uhlíku (CQDs) a jejich cytotoxicita i účinky na zvířecích modelech. Předmětem experimentální části je cytotoxicita CQDs, které mají k uhlíkovému jádru navázaný kvartérní chlorid amonný. Tato povrchová modifikace zajistila kladný povrchový náboj, který do jisté míry ovlivnil biokompatibilní chování vzorku. Byla provedena série testů cytotoxicity (test viability, analýza buněčného cyklu, měření množství ROS), test genotoxicity, analýza koncentrační a časové závislosti internalizace CQDs do buněk, analýza exocytózy CQDs a detekce specifických povrchových CD markerů u hMSC značených CQDs. Vnitrobuněčná distribuce uhlíkových teček byla potvrzena fluorescenční a konfokální mikroskopií. Buňky byly inkubovány s různými koncentracemi CQDs (maximum 400 ?g/ml) po dobu 24 hod, během které docházelo k jejich maximální saturaci částicemi. Fluorescenční mikroskopie ukázala, že dokonce i při minimální použité koncentraci 50 ?g/ml byly CQDs pozorovány uvnitř hMSC jako červené fluorescenční klastry. Ve většině měření byla kritická koncentrace CQDs 200 ?g/ml. Při této dávce bylo pozorováno poškození DNA, zvýšení hladiny ROS a snížení buněčné proliferace, aniž by došlo k výraznému poklesu viability. Tyto kladně nabité CQDs tak představují vhodnou fluorescenční sondu pro značení kmenových buněk v regenerační terapii, avšak při použití koncentrace menší než 200 ?g/ml.

Abstract:

In this thesis, the carbon dots with quaternary ammonium attached on the carbon core through amide linker have been used. Mentioned surface modification gives CQDs positive charge, which could dramatically influence viability of cells. We performed a series of cytotoxicity assays (viability assay, cell cycle measurement, reactive oxygen species assay) and other tests (commet assay, concentration and time dependent uptake of CQDs, analysis of exocytosis, detection of specific surface CD markers, fluorescent and confocal microscopy) to reveal an influence of positive charged CQDs on human mesenchymal stem cells (hMSC). Cells were treated with various concentrations of CQDs up to 400 ?g/ml and incubated for 24 hours, when a maximum amount of CQDs was uptaken by hMSC. Fluorescent microscopy imaging confirmed intracellular presence of CQDs even at minimum dose 50 ?g/ml. The CQDs were visible as a red fluorescent clusters inside hMSC. Critical concentration in all measurements was 200 ?g/ml, where DNA damage and oxidative stress occurred. Cell cycle analysis also showed a decrease in cell growth and proliferation, although no significant viability loss was detected. These positively charged CQDs could be suitable as a fluorescent probe for stem cell labeling in regenerative therapy, but only at concentration less than 200 ?g/ml.

Keywords

cytotoxicita, uhlíkové tečky, průtoková cytometrie, buněčný cyklus, oxidační stres, fluorescenční mikroskopie, kmenové buňky

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Markéta Havrdová

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology