Studium životaschopnosti mikroorganismů pomocí kvantitativní PCR

Mgr. Martina Čechová, Ph.D.

Doctoral thesis

Study of the microorganism viability using quantitative PCR

Abstract:

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) je etiologické agens paratuberkulózy u přežvýkavců a potenciální agens Crohnovy choroby u člověka. Kultivace je považována za standardní metodu umožňující přímou detekci životaschopných buněk MAP, nicméně jejími velkými nevýhodami jsou časová náročnost, pracnost a neschopnost prokázat přítomnost buněk nacházejících se v životaschopném, ale nekultivovatelném stavu. S cílem zkrátit dobu detekce životaschopných buněk MAP byla zavedena rychlá a citlivá molekulární metoda kvantitativní PCR (qPCR) kombinovaná s ošetřením vzorku pomocí interkalačního barviva propidium monoazidu (PMA), jež zprostředkovalo selektivní detekci životaschopných buněk na základě integrity buněčných membrán. PMA-qPCR však vyžaduje náročný postup zahrnující práci ve tmě a udržování bakteriální suspenze na ledu. Hlavním cílem této disertační práce bylo vyvinout a optimalizovat méně náročné alternativní metody k již zavedené PMA-qPCR s využitím DNA-modifikujících sloučenin platiny (Pt) a palladia (Pd). Pt-qPCR a Pd-qPCR byly optimalizovány pro selektivní detekci životaschopných buněk MAP a prokázaly lepší schopnost rozlišit mezi životaschopnými a teplem usmrcenými buňkami MAP ve srovnání s PMA-qPCR. V rámci disertační práce byla také optimalizována digitální PCR pro účely kalibrace kvantifikačních standardů využívaných při qPCR, jejichž precizní příprava je zásadní pro přesnou absolutní kvantifikaci mikrobiálních patogenů pomocí qPCR.

Abstract:

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is an etiological agent of paratuberculosis in ruminants and a potential agent of Crohn’s disease in humans. Cultivation is considered a standard method for direct detection of viable MAP cells, however, it is time consuming, laborious and unable to detect the presence of viable but non-culurable cells. In order to shorten the detection time of viable MAP cells, a rapid and sensitive molecular quantitative PCR (qPCR) method was introduced combined with sample treatment with intercalation dye propidium monoazide (PMA), which mediated selective detection of viable cells based on cell membrane integrity. Nevertheless, PMA-qPCR requires a laborious procedure involving the need to work in the darkroom and keep bacterial suspensions on ice. The main aim of this dissertation was to develop and optimize less demanding alternative methods to already established PMA-qPCR assay using DNA-modifying platinum (Pt) and palladium (Pd) compounds. Pt-qPCR and Pd-qPCR assays for selective detection of viable MAP cells were optimized and demonstrated a better ability to distinguish between viable and heat-killed MAP cells compared to PMA-qPCR assay. As part of the dissertation, digital PCR was also optimized for the purpose of calibration of quantification standards used in qPCR, the precise preparation of which is essential for accurate absolute quantification of microbial pathogens using qPCR.

Keywords

životaschopnost, rozlišení mezi živými a mrtvými buňkami, kvantitativní PCR, mykobakterie, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, platina, palladium, propidium monoazid, kvantifikační plazmidový standard, digitální PCR, absolutní kvantifikace, viability, live-dead discrimination, quantitative PCR, mycobacteria, platinum, propidium monoazide, quantification plasmid standard, digital PCR, absolute quantification

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2022
• Supervisor: Mgr. Iva Slaná, Ph.D.
• Reader: Mgr. Radka Dziedzinská, Ph.D., Ing. Michaela Nesvadbová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Microbiology / Microbiology