Zapojení signálních mitogenem-aktivovaných protein kináz SIMK a SIMKK do modulace procesu tvorby kořenových hlízek u vojtěšky seté

Mgr. Kateřina HLAVÁČKOVÁ

Doctoral thesis

Involvement of signalling mitogen-activated protein kinases SIMK and SIMKK in the modulation of alfalfa nodulation process

Abstract:

Medicago sativa L. (alfalfa) is recognized as one of the most widely grown agronomic crops with fundamental importance to the ecosystem and sustainable agriculture worldwide. This is given by its ability to establish a symbiotic relationship with beneficial soil bacteria that are able to convert atmospheric nitrogen into ammonia, which is assimilated by the host plant. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades represent fundamental and most studied signalling mechanism in plants and regulate various developmental and cellular processes including plant-microbe interactions. In alfalfa, stress-induced MAPK (SIMK) was identified as salt stress- and elicitor-induced MAPK specifically activated by its upstream activator, SIMKK. SIMK role was recently demonstrated also in alfalfa root nodulation but its detailed subcellular distribution remained unknown. First part of the thesis is focused on legume crop M. sativa and methods for its genetic transformation, summarizes the current knowledge about root nodule symbiosis, symbiosis-related MAPKs, plant cytoskeleton and its reorganization during nodule formation, and basic principles of conventional and advanced microscopy approaches implemented in the experimental part of the thesis. Second part is dedicated to detailed subcellular spatial distribution, activation, and developmental relocation of SIMK during alfalfa nodulation. Characterization of SIMK distribution in Ensifer meliloti-infected root hairs was performed by live-cell imaging and immunolocalization using alfalfa stable transgenic lines with genetically manipulated SIMK. In addition, SIMK detailed subcellular localization and activation was characterized in individual nodule developmental zones, preferentially aiming at the symbiotic zone with nitrogen-fixing bacteroids. Plant cytoskeleton represents highly dynamic network and was shown to play a supportive role during root nodule symbiosis. Third part of the thesis describes preparation of alfalfa stable transgenic lines with genetically manipulated SIMK and expression of genetically-encoded cytoskeletal markers through Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and their basic characterization. Altogether, four alfalfa transgenic lines expressing fluorescent molecular markers for either microtubules or actin cytoskeleton were prepared. Cytoskeleton organization was imaged by confocal laser scanning microscopy. Detection of SIMK abundance and presence of fusion proteins in new transgenic lines was performed and confirmed by immunoblot analysis and root hair phenotypes related to their length, which is an important parameter affecting nodulation, were examined.

Abstract:

Medicago sativa L. (vojtěška setá) patří mezi nejrozšířenější zemědělské plodiny se zásadním významem pro ekosystém a udržitelné zemědělství po celém světě. To je dáno především její schopností vstoupit do symbiotického vztahu s prospěšnými půdními bakteriemi přeměňujícími atmosférický dusík na amoniak, který je následně hostitelskou rostlinou asimilován. U rostlin představují kaskády mitogenem-aktivovaných protein kináz (MAPKs) základní a nejvíce studovaný signální mechanismus regulující mnoho vývojových a buněčných procesů, včetně interakcí rostlin s mikroby. Stresem-indukovaná MAPK (SIMK) byla u vojtěšky identifikována jako solným stresem a elicitory indukovaná MAPK, kterou specificky aktivuje nadřazená SIMKK. Nedávno bylo zjištěno, že SIMK hraje úlohu také při procesu tvorby kořenových hlízek, ale její detailní subcelulární distribuce zůstala neobjasněná. První část disertační práce je věnovaná plodině M. sativa a metodám její transformace, souhrnu současných poznatků o symbiotickém procesu, MAPKs zapojených do symbiózy, rostlinném cytoskeletu a jeho reorganizaci během tvorby kořenových hlízek a základním principům konvenčních i pokročilých mikroskopických metod. Druhá část práce je věnovaná podrobné subcelulární prostorové distribuci, aktivaci a vývojové relokalizaci SIMK během procesu tvorby kořenových hlízek (nodulace). Distribuce SIMK v kořenových vláscích interagujících s bakteriemi Ensifer meliloti byla u transgenních linií vojtěšky seté s geneticky manipulovanou úrovní produkce SIMK charakterizována prostřednictvím mikroskopie živých buněk a imunofluorescenčního značení. Detailně byla charakterizována také subcelulární lokalizace a aktivace SIMK v jednotlivých vývojových zónách kořenových hlízek se zaměřením na symbiotickou zónu, ve které se nacházejí dusík-fixující bakteroidy. Rostlinný cytoskelet představuje velmi dynamickou síť a během nodulačního procesu sehrává důležitou úlohu. Třetí část disertační práce popisuje přípravu transgenních linií vojtěšky seté s geneticky modifikovanou expresí SIMK a expresí cytoskeletálních markerů prostřednictvím stabilní transformace s Agrobacterium tumefaciens a jejich základní charakterizaci. Byly připraveny čtyři transgenní linie exprimující fluorescenční molekulární markery pro aktinový cytoskelet nebo mikrotubuly. Organizace cytoskeletu byla dokumentována konfokální laserovou skenovací mikroskopií, imunoblotovou analýzou byla detekována úroveň produkce SIMK a potvrzena přítomnost fúzních proteinů a následná fenotypická analýza byla zaměřená na důležitý parametr ovlivňující proces tvorby hlízek, délku kořenových vlásků.

Keywords

Medicago sativa, vojtěška setá, SIMK, SIMKK, kořenové vlásky, kořenové hlízky, symbióza, Ensifer meliloti, pokročilá mikroskopie, cytoskelet.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 11. 2023

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry