Úloha sirtuinů během formace prvojader po in vitro oplození prasečích oocytů

Veronika Maryníková

Diplomová práce

Role of sirtuins in pronucleus formation in vitro fertilised porcine oocytes

Anotace:

Význam reprodukčních biotechnologií v posledních letech nezadržitelně stoupá. Umožňují dosáhnout vyšší užitkovosti hospodářských zvířat či zdokonalení léčebných postupů v humánní medicíně. Pro rozvoj reprodukčních biotechnologií je zapotřebí zajistit dostatečné množství vývojově kompetentních oocytů a následně zdravých životaschopných embryí pro kultivaci v in vitro podmínkách. Klíčovým momentem, který následuje krátce po oplození, je formace prvojader. Zajištění správného histonového kódu je nezbytné pro správný vývoj raného embrya. Při poruše histonového kódu může dojít k vývojovým defektům až k zániku embrya. Jedním z mechanismů účastnících se regulace histonového kódu, ke kterému se v posledních letech obrací pozornost, jsou NAD+-dependentní histon deacetylázy, známé také jako sirtuiny. Tuto skupinu deacetyláz tvoří sedm izoforem, SIRT1-7, z nichž SIRT1 se zdá být klíčovým pro regulaci časného embryonálního vývoje. Na základě dosavadních poznatků byla stanovena hypotéza, že SIRT1 je přítomen v prasečích zygotách a je zde zapojen do regulace formace prvojader. Pro experiment byly použity prasečí COCs, které byly vystaveny 44 hod. in vitro zrání. Po ukončení kultivace byly vybrány zralé oocyty a tyto byly dále použity pro in vitro oplození. Zygoty byly kultivovány spolu s inhibitorem sirtuinů, nikotinamidem, či se specifickým inhibitorem SIRT1, sirtinolem. Po 22 hod. kultivace in vitro byly zygoty podrobeny imunocytochemické lokalizaci acetylovaného a metylovaného histonu H3 na lysinu 9 (K9) a analýze obrazu. Ze získaných výsledků je patrné, že SIRT1 je přítomný v prasečích zygotách, kde je jeho lokalizace směřována především do prvojader. Po inhibici SIRT1 byly patrné změny na hladině acetylace a metylace H3K9, kdy došlo k signifikantnímu nárůstu acetylovaného H3K9 a naopak poklesu methylovaného H3K9. Použití sirtinolu potvrdilo, že tyto změny histonového kódu způsobuje zejména SIRT1. Zapojení SIRT1 do regulace histonového kódu ve fázi formace prvojader prasat je však neuspokojivě probádaná oblast výzkumu, která vyžaduje podrobnější objasnění mechanismů účinků.

Abstract:

Recently, the increasing importance of reproductive biotechnologies rises. They provide us to get higher performance of livestock or to improve treatment in human medicine. It is neccessary to have a sufficient amount of developmentaly competent oocytes and further healthy liveable embryos for in vitro culture to supply a progress of reproductive technologies. Immediately after fertilization, pronucleus formation is a key moment for further embryonicdevelopment. Male and female pronuclei have their own pattern of histone code. For development of early embryo, it is neccessary to supply the correct pattern of histone code. NAD+-dependent histon deacetylases, sirtuins, are one of the mechanism which plays in regulation of histone code. These family contains seven isoforms, SIRT1-7. Based on current research, we decided for hypothesis that sirtuins are present in porcine fertilized oocytes and regulate the pronucleus formation. In this thesis, porcine COCs were culture in modificated culture medium and after 44 hr. maturation, only oocytes with extruded first polar body were chosen and used for further in vitro fertilization. Presumed zygotes were subsequently cultured with sirtuins inhibitors, nicotinamide or sirtinol. After 22 hr. of in vitro culture, zygotes were subjected by imunocytochemicaly localization of methylated and acetylated (on lysine K9) histone H3 and image analysis. Our results show that SIRT1 is localizated in porcine zygotes, especially in pronuclei. There are changes in acetylation and methylation H3K9 after sirtuin inhibition. Significant increase of H3K9 acetylation and decrese in H3K9 methylation are appeared. Sirtinol usage has confirmed that the changes are result of SIRT1 action. Role of SIRT1 in histone code regulation of pronucleus formation is still not enought described in porcine.

Klíčová slova

oocyt, zygota, prvojádro, sirtuin, SIRT1, in vitro oplození

Keywords

in vitro fertilization, zygote, pronucleus, SIRT1, oocyte

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 8. 4. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Tereza Žalmanová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Genové technologie a šlechtění / Reprodukční biotechnologie