Molekulární diagnostika mnohočetného myelomu s využitím komparativní genomové hybridizace na oligonukleotidových DNA čipech (array-CGH)

Mgr. Jan Smetana, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular diagnostics of multiple myeloma using oligonucleotide array-base comparative genomic hybridization (array-CGH)

Anotácia:

V této práci byla hodnocena přítomnost nebalancovaných chromozomových změn (CNAs) u souboru 184 vzorků od pacientů s mnohočetným myelomem (MM) vyšetřených pomocí techniky komparativní genomové hybridizace na oligonukleotidových mikročipech (array-CGH). Cílem bylo prokázat a upřesnit na celogenomové úrovni prognosticky významné chromozomové aberace charakteristické pro vznik a progresi MM. Doplňující detekce přestaveb genu IGH a translokace t(4;14)(p16;q32) byla hodnocena pomocí techniky FISH. Celogenomové profilování pomocí array-CGH potvrdilo přítomnost dvou geneticky odlišných podskupin MM. U pacientů s hyperdiploidním karyotypem (H-MM, 46,2 %) byl pozorován častý výskyt trizomií (nadbytečných kopií) chromozomů 15 (41,8 %), 9 (39,7 %) a 19 (38,0 %), zatímco přítomnost non-hyperdiploidního karyotypu (NH-MM, 53,8 %) byla charakterizována častějším výskytem monozomií (ztrát kopií) chromozomů 13 (53,8 %), X (25,0 %) a 14 (16,9 %) a také vyšší četností chromozomových aberací s negativním vlivem na prognózu (zisk 1q21, delece genu TP53, translokace IGH/FGFR3). Četnost chromozomových abnormalit s prognostickým významem byla následující: zisk 1q21 - 59,8 %, delece 1p32 - 19,3 %, delece genu TP53 - 13,1 %, delece genu RB1 - 65,8 % a translokace t(4;14)(p16;q32) - 20,47 %. Výskyt homozygotních delecí (HZD) byl pozorován u 25,5 % vzorků a byl asociován s přítomností NH-MM karyotypu a strukturních chromozomových aberací s negativním prognostickým významem. Přítomnost úseků ztrát heterozygotnosti (LOH) byla hodnocena u podskupiny 49 pacientů s MM. Regiony s výskytem LOH byly nalezeny u 24,4% vzorků, nejčastěji byla postižena oblast 6q (8,2 %). Chromotripsis byla nalezena v oblasti Xq a na chromozomu 18 ve dvou případech (1,1 %). Ve vztahu k prognostickému významu vyšetřených aberací byla delece genu TP53 u pacientů v primoléčbě spojena s horší prognózou (medián OS: 15,3 vs. 33,2 měsíců; P = 0,014; medián TTP: 8,4 vs. 14,5 měsíců; P = 0,044). Negativní vliv na prognózu u pacientů v primoléčbě měla i přítomnost více než 20 CNAs (medián OS: nedosažen vs. 18,1 měsíců; P < 0.0001; medián TTP 10,6 vs. 18,8 měsíců; P = 0,037). Nepříznivý vliv na délku OS jsme prokázali i za přítomnosti zisk 1q a hyperdiploidie, rozdíly však nebyly statisticky signifikantní. U relabovaných pacientů byl pozorován negativní vliv t(4;14)(p16;32) na délku OS (medián 13,2 vs. 21,4 měsíců; P = 0,022). Sledování chromozomových změn v čase prokázalo, že výskyt rizikových chromozomových aberací se v průběhu onemocnění nemění a s jeho postupným vývojem dochází k akumulaci přídatných aberací. V rámci modelové kazuistiky pacientky z IHOK FN Brno jsme zjistili, že náhlá změna genomového profilu detekovaná pomocí array-CGH může vést k agresivnímu průběhu onemocnění a lze ji považovat za nepříznivý prognostický faktor. Výsledky prezentované v této přinášejí další informace o biologii a genomové nestabilitě MM a rozšiřují také poznatky o možnostech využití techniky celogenomového screeningu v diagnostice tohoto onemocnění. Na základě výsledků získaných v průběhu vypracování této disertační práce byla technika array-CGH od roku 2013 zařazena do rutinního algoritmu cytogenetických vyšetření prováděných u nově diagnostikovaných pacientům s MM v rámci FN Brno.

Abstract:

In this thesis we study incidence of unbalanced copy number aberrations (CNAs) in cohort of 184 samples from patients with multiple myeloma (MM) detected by comparative genomic hybridization technique with the use of oligonucleotide-based microarrays (array-CGH). The main aim was to verify the incidence and evaluate effect of CNAs on prognosis of MM patients. The occurrence of IGH rearrangements and translocation t(4;14)(p16;32) was subsequently evaluated by FISH technique. Genome-wide screening by array-CGH verified the presence of two genetic subgroups among MM patients. In patients with hyperdiploid karyotype (H-MM, 46.2%) was frequently observed trisomy (additional copy) of chromosomes 15 (41,8%), 9 (39,7%) a 19 (38,0%), whereas presence of non-hyperdiploid karyotype (NH-MM, 53.8%) was characterized by common incidence of monosomy (loss of one copy) of chromosome 13 (53,8%), X (25,0%) a 14 (16,9%) and higher occurrence of genetic lesions associated with adverse prognosis (gain 1q21, , deletion TP53 and translocation IGH/FGFR3). Incidence of those high-risk aberrations was as follows: gain 1q21 – 59.8%, loss 1p32 – 19.3%, deletion of TP35 – 13.1% and translocation t(4;14)(p16;q32) – 20.5%. Regions affected with homozygous deletion (HZD) were found in 25.5% of samples and were in association with presence of NH-MM karyotype and high-risk chromosomal aberrations. Incidence of areas with copy neutral loss of heterozygosity (LOH) was evaluated in 49 MM samples. We observed LOH regions in 24.4% of samples with the most commonly affected region in chromosome 6q (8.2%). Chromotripsis was found in 2 samples (1.1%) in Xq and whole chromosome 18. The incidence of loss TP53 was associated with adverse prognosis for newly diagnosed patients in our cohort (median OS: 15.3 vs. 33.2 months, P = 0,014; median TTP: 8.4 vs. 14.5 months; P = 0.044). Similarly, negative prognostic impact was also found in patients with more than 20 CNAs detected by array-CGH (median OS: not reached vs. 18.1 months, P < 0.0001; median TTP: 10.6 vs. 18.8 months, P = 0,037). Shorter OS was also found in patients with gain 1q and H-MM karyotype; however the differences were not statistically significant. The evaluation of presence of chromosomal aberrations in different stages of the disease showed that presence of high-risk genetic lesions is not changing and novel CNAs are accumulated in the genome of PCs during the development of the disease. The case report from IHOK FN Brno also showed that radical change of genomic profile detected by array-CGH could lead to very aggressive course of the disease and thus should be considered as negative prognostic factor. The results presented in thesis bring further information about and genomic instability of MM and thus expand our knowledge about biology of this disease. Based on the results of this thesis was array-CH technique in 2013 acknowledged as part of routine diagnostic algorithm of cytogenetic evaluations for newly diagnosed patients with MM

Kľúčové slová

Mnohočetný myelom, Molekulární diagnostika, Array-CGH, Celogenomový screening, Prognostické faktory, Klonální evoluce

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 9. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 10. 2014
• Vedúci: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.
• Oponent: prof. MUDr. Vladimír Maisnar, Ph.D., prof. RNDr. Mgr. Marie Jarošová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / General and Molecular Genetics