Fosforylace proteinů hřebčích spermií jako indikátor kapacitace

Bc. Natálie Brabencová

Diplomová práce

Stallion sperm protein phosphorylation as an indicator of capacitation

Anotace:

Ejakulované spermie nejsou schopné oplodnit oocyt, proto musí spermie podstoupit sérii funkčních změn souhrnně označovaných jako kapacitace. Hlavní pozorované děje během kapacitace jsou změny v metabolismu buňky, uspořádání plazmatické membrány a hyperaktivace motility. In vivo jsou tyto procesy vyvolány kontaktem spermie s oviduktem. V laboratorních podmínkách bylo zjištěno, že na zahájení kapacitace většiny savců mají vliv 3 iniciační faktory: HCO3, Ca2+ a albumin. HCO3- aktivuje adenylátcyklázu, která zahajuje tvorbu cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP). Produkce cAMP slouží k aktivaci proteinkinázy A nutné k fosforylaci proteinů na tyrosinu, která je spojována s hyperaktivací motility bičíku a je brána jako marker kapacitace. Tyto 3 iniciační faktory vedou pouze k částečné kapacitaci u hřebčích spermií, proto se zdá se, že u hřebce probíhá kapacitace specifickým, zatím neznámým způsobem. Tato práce se zabývala hodnocením rozdílu fosforylace proteinů hřebčích spermií mezi nativními a kryokonzervovanými vzorky. Během kryokonzervace často dochází k nežádoucím změnám podobným kapacitaci označovaných jako kryokapacitace. Kryokapacitované spermie nejsou vhodné k oplození. Nejdříve byla v této práci hodnocena lokalizace fosforylovaných proteinů u nativních a kryokonzervovaných vzorků hřebčích spermií pomocí imunofluorescenční mikroskopie. Byly objeveny jisté rozdíly v lokalizaci signálu mezi porovnávanými vzorky. U nativních vzorků převládal signál v oblasti ekvatoriálního segmentu a zároveň bičíku, zatímco u kryokokonzervovaných vzorků byl nejčastější signál v oblasti akrozomu, ekvatoriálního segmentu a bičíku zároveň. Signál v oblasti bičíku byl výraznější v oblasti střední části u nativních vzorků, u kryokonzervovaných byl signál v celém bičíku rovnoměrný. Signál v ekvatoriálním segmentu nativních vzorků byl rozmístěn rovnoměrně po celém segmentu, zatímco u kryokonzervovaných byl uspořádán uprostřed do tvaru trojúhelníku. Byla hodnocena také přítomnost akrozomu a detekce signálu protilátky proti fosfotyrosinu. Přítomnost nebo nepřítomnost akrozomu neměla vliv na detekci signálu v této oblasti. Pomocí metody Western Blot imunodetekce byla hodnocena míra signálu fosforylovaných proteinů hřebčích spermií. U kryokonzervovaných vzorků bylo detekováno větší množství proteinů se signálem proti fosfotyrosinu než u nativních vzorků. Mezi jednotlivými hřebci byl patrný rozdíl v míře detekovaného signálu. Z toho vyplývá individuální citlivost hřebců na kryokonzervaci a kryokapacitační změny.

Abstract:

Ejaculated sperm are not able fertilize oocyte, tehrefore spermatozoa must undergo series of functional changes described as capacitation. Main described events during capacitation are changes in sperm metabolism, reorganisation of plasma membrane and hyperactivation motility of a sperm tail. These changes are in vivo iniciated after contact of spermatozoa with the female oviduct. In laboratory conditions, three iniciating factors of capacitation for most mammalians were discovered: HCO3-, Ca2+ and albumin. HCO3- activates adenylat cyklase A which iniciates releasing cyclic adenosin monophosphate (cAMP). Production of cAMP activates also protein kinase A necessary for protein tyrosine phosphorylation. Protein tyrosine phosphorylation is connected with sperm tail hyperactivation and is used as a marker of capacitation. These three iniciating factors of capacitation lead not to full capacitation in horse, therefore, the stallion appears to be capacitated in a specific, as yet unknown manner. This work compared differences in protein tyrosine phosphorylation between native and cryopreserved stallion sperm. During cryopreservations sperm often undergo undesirable changes similar to capacitation described as cryocapacitation. Sperm which undergo cryocapacitation changes are not suitable for fertilization. In this work localization of phosphorylated proteins in native and cryopreserved samples was observed using immunofluorescence microscopy. Particular differences in the localization of the signal were observed. In native samples, dominated signal located in the equatorial segment and sperm tail simultaneously, whilst in cryopreserved sperm dominated signal is located in the acrosome, equatorial segment, and sperm tail simultaneously. Detected signal was stronger in midpiece of a sperm tail in native samples, whilst in cryopreserved samples was signal equal throughout sperm tail. The observed signal in equatorial segment was equal in native sperm, in croopreserved sperm it was located in the middle in a shape of a triangle. Presence of acrosome and signal of protein tyrosine phosphorylation was studied. Presence or absence of acrosome did not affect signal in this area. Using method of Western Blot imunodetection was detected measurement of signal of phosphorylated proteins in stallion sperm. In cryopreserved samples more phosphorylated proteins were detected than in native samples. Differences in the measurement of observed signal between particular stallions were detected. In conclusion, stallions seem to have different sensitivity on cryopreservation and cryocapacitation.

Klíčová slova

fosforylace, spermie, hřebec, kapacitace, kryokonzervace, kryokapacitace

Keywords

phosphorylation, sperm, stallion, capacitation, cryopreservation, cryocapacitation

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 4. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Filipa Bubeníčková, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie