Příprava vzorků z rostlinných matric pro proteomickou analýzu

Mgr. Petra Martinková, Ph.D.

Doctoral thesis

Preparation of plant samples for proteomic analysis

Anotácia:

Proteomika je jeden ze základních nástrojů k lepšímu pochopení biologických systémů. U rostlin protemika přispívá nejen k získání základních biologických poznatků, ale má také praktické využití v zemědělství, enviromentálních vědách a biotechnologiích. Při získávání komplexních a spolehlivých informací o proteomu vzorku našeho zájmu nelze spoléhat pouze na vývoj analytických přístrojů a softwarů pro zpracování dat. Stejně důležité je také zaměřit se na rozvoj metod pro přípravu vzorků. V případě nejčastěji používaného proteomického přístupu “bottom-up” jsou extrahované proteiny štěpeny na peptidy, které jsou pak analyzovány pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Takto, úspěch analýzy často závisí na účinnosti odstranění kontaminací ze vzorku peptidů. Přítomnost kontaminací ve vzorku může mít negativní vliv na identifikaci a kvantifikaci peptidů, což dále může ovlivnit následnou identifikaci a kvantifikaci proteinů. Tato práce byla věnována zejména využití SP2 protokolu pro odstranění běžných kontaminant. Byla testována jeho efektivnost při odstranění dodecylsíranu sodného (SDS) a směsi polyethylen glykolů (PEG) z tryptických peptidů získaných z A. thaliana. Navržený SP2 protokol byl testován na 10ng, 250ng and 10µg peptidových vzorcích a byl porovnán s ethyl-acetátovou extrakcí. SP2 protokol se ukázal jako robustnější přístup, a to i při přečištění peptidů kontaminovaných současně SDS i PEG. V druhé části práce byla hodnocena účinnost extrakce proteinů z rostlin máku za použití běžně používaného SDT lyzačního pufru a TRIzolových reagencií. Přestože SDT pufr vykazoval mírnou výhodu ve výtěžku peptidů a proteinů, obě metody byly shledány jako účinné pro extrakci proteinů.

Abstract:

Proteomics is a fundamental tool for advancing our understanding of biological systems at the functional level. In plants, proteomics not only contributes to the acquisition of fundamental biological knowledge but also has practical applications in agriculture, environmental science, and biotechnology. In order to obtain comprehensive and reliable information about the proteome of the sample of interest, it is not sufficient to focus solely on the development of analysing instruments and processing software. It is equally important to concentrate on the improvement of sample preparation methods. In the bottom-up approach, which is the most frequently utilised in mass spectrometry-based proteomics, extracted proteins are processed into peptides, which are then subjected to analysis by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. The success of analysis frequently depends on the efficient removal of contaminants from peptide samples. The presence of contaminants in the sample may have a negative effect on the identification and quantification of peptides, which in turn may impact the subsequent identification and quantification of proteins. This thesis focuses mainly on the single-pot, solid-phase-enhanced peptide sample preparation on carboxylate-modified paramagnetic beads (termed SP2), which was evaluated for sodium dodecyl sulphate (SDS) or polyethylene glycol mixture (PEG) removal from A. thaliana tryptic peptides. The SP2 proto-col, tested for 10 ng, 250 ng, and 10 µg peptide samples, was proposed and bench-marked thoroughly against the ethyl acetate extraction protocol. The SP2 protocol proved to be more robust approach, even for the simultaneous removal of SDS and PEG contaminations from peptide samples. In the second part, the efficacy of the commonly used SDT lysis buffer and TRIzol reagents for the protein extraction of opium poppy plants was evaluated. Despite the SDT buffer demonstrating a slight advantage in terms of overall protein and peptide yields, both methods were found to be effective for protein extraction.

Keywords

rostliny, proteomika, lyze, extrakce proteinů, kontaminace, přečištění peptidů, SDS, PEG, LC-MS/MS, plants, proteomics, lysis, protein extraction, contamination, peptide clean-up

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 8. 11. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 27. 11. 2024
• Vedúci: prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
• Oponent: prof. RNDr. Karel Lemr, Ph.D., Mgr. Martin Hubálek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics