Vývoj metod pro stanovení vybraných léčiv používaných při léčbě roztroušené sklerózy pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí

Mgr. Veronika PEŠÁKOVÁ

Disertační práce

Development of methods for the determination of selected drugs used in the treatment of multiple sclerosis by liquid chromatography coupled with mass detection

Anotace:

Tato dizertační práce se věnuje vývoji metod pro stanovení koncentrace vybraných léčiv používaných při léčbě roztroušené sklerózy z krevního séra nebo plné krve. V teoretické části je rozebrána problematika roztroušené sklerózy, farmakologických vlastností vybraných léčiv, terapeutického monitorování léčiv a analýzy vybraných analytů. V experimentální části byly popsány nově vyvinuté a validované metody ultraúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí pro stanovení koncentrace celkového a volného teriflunomidu, monomethyl fumarátu (aktivní metabolit podávaného dimethyl fumarátu), kladribinu a fampridinu v krevním séru a metoda pro stanovení fingolimodu a jeho aktivního metabolitu fingolimod fosfátu v plné krvi. Pomocí těchto metod byly analyzovány reálné krevní vzorky pacientů s roztroušenou sklerózou, kteří užívají tato léčiva. Metoda pro stanovení koncentrace celkového teriflunomidu byla zavedena do rutinní praxe v rámci terapeutického monitorování léčiv na Oddělení klinické farmakologie Fakultní nemocnice Ostrava. Pro úpravy vzorků krevního séra a krve před chromatografickou analýzou byly použity přípravy pomocí precipitace proteinů různými srážecími činidly. Pro získání ultrafiltrátu krevního séra ke stanovení koncentrace volné frakce teriflunomidu byla použita metoda ultrafiltrace. Koncentrace uvedených léčiv byly detekovány pomocí kapalinového chromatografu Acquity UPLC ve spojení s hmotnostním spektrometrem XEVO TQ-XS. Separace byla testována na třech chromatografických kolonách, nejlepších výsledků bylo dosaženo na koloně Acquity UPLC BEH C18 1,7 ?m (100 x 2,1 mm) při teplotě 30 °C. Jako mobilní fáze byla testována různá rozpouštědla o různém složení a při použití různých průtoků. Pro kvantifikaci analytů pomocí metody vnitřního standardu byly použity jejich izotopově značená analoga, pouze pro kladribin byl zvolen jako vnitřní standard mitoxantron-D8. Pro teriflunomid, fingolimod a fingolimod fosfát byly testovány dvě ionizační techniky, a to ionizace elektrosprejem a chemická ionizace za atmosferického tlaku. Teriflunomid, monomethyl fumarát a jejich vnitřní standardy byly detekovány při ionizaci elektrosprejem v negativním módu, ostatní léčiva a jejich vnitřní standardy vykazovaly vyšší odezvu v pozitivním módu. Vyvinuté metody byly validovány dle pravidel Evropské lékové agentury pro validaci bioanalytických metod. Všechny metody umožňují rychlé a snadné stanovení koncentrace uvedených léčiv v biologických vzorcích a jsou použitelné v rutinní analýze. Pomocí nově vyvinutých metod byly analyzovány biologické vzorky pacientů užívajících tato léčiva, které byly shromážděny v rámci získaného studentského grantu SGS12/LF/2021. Bylo odebráno a analyzováno 94 vzorků od pacientů léčených teriflunomidem a u všech byla stanovena koncentrace celkového teriflunomidu v krevním séru. Z těchto vzorků byla u 79 vzorků analyzována i volná frakce teriflunomidu. Podíl volného teriflunomidu byl 0,15-0,40 % z celkového množství a mezi koncentrací volného a celkového teriflunomidu byla prokázána významná korelace R2 = 0,9083 (p < 0,001). Dále bylo analyzováno 50 vzorků od pacientů užívajících fingolimod, 42 vzorků monomethyl fumarátu, 13 vzorků kladribinu a 3 vzorky fampridinu. Metoda pro stanovení koncentrace celkového teriflunomidu byla převedena na Oddělení klinické farmakologie Fakultní nemocnice Ostrava. V rutinní praxi slouží tato metoda především při podezření na non-compliance pacienta a k potvrzení poklesu sérové koncentrace teriflunomidu pod 0,02 mg/l u pacientek s RS plánujících těhotenství nebo u pacientů při eskalaci léčby.

Abstract:

This dissertation is devoted to the development of methods for determining the concentration of selected drugs used in the treatment of multiple sclerosis from blood serum or whole blood. In the theoretical part, the issue of multiple sclerosis, pharmacological properties of selected drugs, therapeutic monitoring of drugs and analysis of selected analytes is analyzed. In the experimental part, newly developed and validated methods of ultra-performance liquid chromatography in conjunction with mass detection were described for determining the concentration of total and free teriflunomide, monomethyl fumarate (the active metabolite of administered dimethyl fumarate), cladribine and fampridine in blood serum, and a method for determining fingolimod and its active of fingolimod phosphate metabolite in whole blood. Using these methods, real blood samples from multiple sclerosis patients taking these drugs were analyzed. The method for determining the concentration of total teriflunomide was introduced into routine practice as part of therapeutic drug monitoring at the Department of Clinical Pharmacology of the Ostrava University Hospital. For the treatment of blood serum and blood samples before chromatographic analysis, preparations using protein precipitation with various precipitating agents were used. The ultrafiltration method was used to obtain the blood serum ultrafiltrate to determine the concentration of the free fraction of teriflunomide. Concentrations of the listed drugs were detected using an Acquity UPLC liquid chromatograph in conjunction with a XEVO TQ-XS mass spectrometer. The separation was tested on three chromatographic columns, the best results were obtained on an Acquity UPLC BEH C18 1.7 ?m (100 x 2.1 mm) column at 30 °C. Different solvents with different compositions and using different flow rates were tested as mobile phases. For the quantification of analytes using the method of internal standards, their isotopically labeled analogues were used, only for cladribine mitoxantrone-D8 was chosen as the internal standard. Two ionization techniques were tested for teriflunomide, fingolimod and fingolimod phosphate, electrospray ionization and atmospheric pressure chemical ionization. Teriflunomide, monomethyl fumarate and their internal standards were detected by electrospray ionization in negative mode, other drugs and their internal standards showed a higher response in positive mode. The developed methods were validated according to the rules of the European Medicines Agency for the validation of bioanalytical methods. All methods enable quick and easy determination of the concentration of the mentioned drugs in biological samples and are applicable in routine analysis. Using newly developed methods, biological samples of patients using these drugs, which were collected as part of the obtained student grant SGS12/LF/2021, were analyzed. Ninety-four samples from patients treated with teriflunomide were collected and analyzed, and total serum teriflunomide concentrations were determined in all of them. The free fraction of teriflunomide was also analyzed in 79 samples. The proportion of free teriflunomide was 0.15-0.40% of the total amount, and a significant correlation R2 = 0.9083 (p < 0.001) was demonstrated between the concentration of free and total teriflunomide. Furthermore, 50 samples from patients taking fingolimod, 42 samples of monomethyl fumarate, 13 samples of cladribine and 3 samples of fampridine were analyzed. The method for determining the concentration of total teriflunomide was transferred to the Department of Clinical Pharmacology of the Ostrava University Hospital. In routine practice, this method is mainly used when patient non-compliance is suspected and to confirm a drop in the serum concentration of teriflunomide below 0.02 mg/l in MS patients planning pregnancy or in patients during treatment escalation.

Klíčová slova

roztroušená skleróza, kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, validace, léčiva používaná k léčbě roztroušené sklerózy

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 9. 2024

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Hana Brozmanová, CSc., RNDr. Hana Brozmanová, CSc.

OSTRAVSKÁ UNIVERZITA

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Klinické neurovědy / Klinické neurovědy