Axonal transport of neurodegenerative-disease linked proteins

Monica Feole, M.Sc.

Disertační práce

Anotace:

Abstrakt Úvod Axonální transport je vysoce regulovaný proces, který zajišťuje dodávku široké škály nákladových molekul nezbytných pro růst a přežití neuronů. Tyto náklady neustále putují podél mikrotubulů rychlostí 50-400 mm/den pomocí kinesinů a dyneinů, hlavních motorových proteinů odpovědných za transport směrem k axonovému terminálu a tělu buňky, respektive. Vzhledem k centrální roli axonálního transportu při udržování organel a distribuci synaptických váčků, lokální translaci mRNA, pohybu růstových faktorů a dalších je neméně překvapivé, že dochází k jeho poruchám při neurodegenerativních onemocněních jako je AD nebo ALS. Zatímco několik studií přispělo k porozumění axonálního transportu, mechanismus, kterým dochází k jeho poruchám během patogeneze, zůstává málo pochopený. V této studii zkoumám axonální transport proteinu amyloidového prekurzoru (APP) a proteinu Tar-DNA vázajícího protein-43 (TDP-43), dva klíčové aktéry jak v sporadických, tak familiárních případech AD a ALS, odpovídajícím způsobem. Občas definovaný jako prion-like proteiny, APP a TDP-43 tvoří neurotoxické agregáty během patologie a oba procházejí axonálním transportem, aby vykonávaly své funkce na různých místech v buňce. Zde demonstruji, že navzdory sdílení stejných typů motorových proteinů mohou nákladové molekuly s různými funkcemi vykazovat významně odlišnou dynamiku transportu. Metody Centrálním modelem této studie byly embryonální kmenové buňky (ESC) odvozené od lidských neuronů, které byly použity k charakterizaci axonálního transportu přeexpresí nákladů spojených s fluorescenční značkou pro vizualizaci jejich pohybu. K posouzení interakcí mezi náklady a motorovými proteiny byly provedeny biochemické analýzy, zobrazování a další analýzy pomocí metody Proximity Ligation Assays (PLA). Tyto analýzy byly prováděny v různých modelech, včetně neuronů odvozených z indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) zdravých jedinců nebo pacientů s mutací způsobující AD nebo postižených sporadickou ALS (sALS), divokých typů nebo transgenních myších modelů s mutací způsobující AD a neuroblastomové buněčné linie SH-SY5Y. Výsledky V první studii byly zkoumány patogenní varianty APP spojené s AD. Skrz detailní analýzu axonálního transportu jsem prokázal, že tyto mutace ovlivňují nejen kanonický anterográdní transport APP, ale také narušují transport Ran5 a ranvylisozomy, které jsou důsledkem narušení regulace retrográdního motorového systému. Ve druhé studii jsem charakterizoval dynamiku transportu TDP-43, objasňující molekulární motory, které regulují jeho pohyb. Naše zjištění zdůrazňují rysy TDP-43 fyziologického transportu, odhalující variabilní anterográdní pohyb podporovaný různými kinesinovými rodinami, konkrétně kinesinem-1 a kinesinem-3. Vzhledem k tomu, že mislokace TDP-43 během patologie může ovlivnit jeho funkce, zkoumal jsem fenotyp TDP-43 v modelu iPSC odvozeném od sporadické ALS, což ukázalo akumulaci proteinu v axonálních projekcích. Závěr Tyto zjištění posouvají naše porozumění fyziologickým a patologickým aspektům pohybu jak APP, tak TDP-43 a nabízejí nové důkazy o porušení axonálního transportu během progrese neurodegenerativních onemocnění jako jsou AD a ALS.

Abstract:

Abstract Introduction Axonal transport is a highly regulated process that ensures the delivery of a wide range of cargo molecules essential for neuronal growth and survival. These cargoes are constantly moving along microtubules at speeds of 50-400 mm/day by kinesin and dynein, the primary motor proteins responsible for transport toward the axon terminal and the cell body, respectively. Considering the central role of axonal transport in the maintenance of organelles and synaptic vesicles distribution, local mRNA translation, growth factors movement, and others it is not surprising that it becomes impaired in neurodegenerative diseases such as AD or ALS. While several studies have contributed to the understanding of axonal transport, the mechanism underlying its impairment during pathogenesis remains poorly understood. In this study, I investigate the axonal transport of Amyloid Precursor Protein (APP) and Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43), two key players in both sporadic and familial cases of AD and ALS, respectively. Often defined as prion-like proteins, APP and TDP-43 both form neurotoxic aggregates during pathology, and both undergo axonal transport to exert their functions in different locations within the cell. Here, I demonstrate that, despite sharing the same type of motor proteins, cargoes carrying different functions can exhibit significantly varied transport dynamics. Methods Embryonic Stem Cell (ESC)-derived human neurons were the central model of this study and were used to characterize axonal transport by overexpressing cargoes fused with a fluorescent tag to visualize their movement. To assess the interactions between cargoes and motor proteins, biochemical analyses, imaging, and additional Proximity Ligation Assays (PLAs) were conducted. These analyses were performed in multiple models, including ESC-derived neurons, induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-derived neurons from healthy individuals or patients carrying either a mutation causing AD or affected by sporadic ALS (sALS), wildtype or transgenic mouse models carrying an AD-causing mutation, and neuroblastoma-derived cell line SH-SY5Y. Results In the first study, APP pathogenic variants associated with AD were investigated. Through a detailed axonal transport analysis, I demonstrate that these mutations not only affect the canonical anterograde transport of APP but also disrupt the transport of Rab5 early endosomes and lysosomes, resulting from impaired regulation of the retrograde motor machinery. In the second study, I characterize the transport dynamics of TDP-43, elucidating the molecular motors that regulate its movement. Our findings highlight the features of TDP-43 physiological transport, revealing a versatile anterograde movement supported by different kinesin families, namely kinesin-1 and kinesin-3. Finally, considering that mislocalization of TDP-43 during pathology can impact its functions, I examine the phenotype of TDP-43 in an iPSC-derived model of sporadic ALS, demonstrating the accumulation of the protein in axonal projections. Conclusion These findings advance our understanding of the physiological and pathological aspects of both APP and TDP-43 movement and offer new evidence on axonal transport impairment during the progression of neurodegenerative diseases like AD and ALS. First, I observe that pathogenic APP induces changes at different levels in the neuronal metabolism. This includes the changed regulation of the retrograde motor machinery involving dynein and dynactin, and the consequent impairment of endolysosomal pathway distribution and morphology, which can lead to an impaired clearance of material from the cell. This will result in a crowded environment which can cause traffic jams of other molecules as well, thereby disrupting also other processes. Second, while cargoes like Rab5, synaptophysin, and APP, have a clear coordination of their transport regulated by specific kinesin isoforms, I here show that TDP-43 anterograde

Abstract:

axonal transport can be coordinated by multiple kinesins that have different motion dynamics. This result shows that RNA binding proteins (RBPs) like TDP-43 follow versatile transport mechanisms, aiming at guaranteeing the correct distribution of mRNAs along the axon. For this reason, the maintenance of the correct distribution of TDP-43 in the axon is imperative, otherwise it would accumulate and impair RNA transport and translation. Altogether these studies show how relevant is the job of the axonal transport machinery, and how defects in one of the members of this complex factory can generate a cascade of events that ultimately precipitate neuronal degeneration.

Keywords

Amyloid Precursor Protein, Tar DNA Binding Prtoein-43, axonal transport, Amyotrophic Lateral Sclerosis, Alzheimer's disease, neurodegenerative disease, motor protein, cargo. Protein prekurzor amyloidu, Tar DNA vázající protein-43, axonální transport, Amyotrofická laterální skleróza, Alzheimerova choroba, neurodegenerativní choroba, motorický protein, náklad.

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 7. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 10. 2024
• Vedoucí: Ph.D. Gorazd Bernard Stokin
• Oponent: Kenneth L. Moya, Ph.D., Emanuele Buratti, Ph.D.

Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biomedical Sciences / Biochemistry and Molecular Biology