Interakce různých forem proteinu p53 s p73 izoformami

Bc. Martin Klepárník, Ph.D.

Master's thesis

Abstract:

Tumor supresorový protein p53 je nezbytný při kontrole buněčného růstu a udržení stability genomu. Tyto jeho funkce jsou uskutečňovány prostřednictvím tvorby homooligomerů, které se vážou na specifické DNA sekvence a aktivují tranksripci. V nedávné době byly objeveny homology proteinu p53 proteiny p73 (kódován genem TP73) a p63 (kódován genem TP63). Mutace v tumor supresorovém genu p53 (TP53) se nachází přibližně u 55% lidských nádorů, 95% těchto mutací pak leží v centrální DNA vazebné doméně. Některé mutace, výrazně ovlivňující schopnost vazby na DNA, se v mutacích objevují častěji jsou označovány jak hot-spot mutace. Mutace se nachází buď v oblasti vazby na DNA nebo destabilizují konformaci DNA vazebné domény. p73 není klasickým tumor supresorovým genem, protože mutace v genu TP73 jsou narozdíl od genu TP53, velmi zřídka přítomny v lidských nádorech. p53 a p73 proteiny mají vysoký stupeň strukturní homologie, především v DNA vazebné doméně. Gen TP73 může být translatován do různých isoforem proteinu p73, které mají různou transaktivační a DNA vazebnou schopnost a také protein-protein interakční potenciál. Za fyziologických podmínek jsou interakce mezi proteiny p53 a p73 velmi slabé, ale u některých mutantů p53 se ukazuje schopnost interakce s p73. Snížení aktivity isoforem p73, způsobené interakcí s mutantním proteinem p53, může ovlivnit schopnost p73 indukovat apoptózu jako odpověď na působení genotoxických agens. V naší práci jsme se zaměřili na studium fyzikálních a funkčních interakcí mezi mutantními proteiny p53 a isoformami p73. Analyzovali jsme specifitu a afinitu vazby mutantních p53 proteinů (285K p53, p53beta, 175H(P) p53 and 175(R)H p53), isoforem p73beta a p73delta a předpokládaných komplexů mutantního p53 s p73 na p53-responzivní elementy pomocí metody EMSA (electromobility shift-assay). Používaly jsme IVTT (in vitro transkribované/translatované) proteiny nebo jaderné a cytosolické lyzáty buněčných linií. Za in vitro podmínek se nám nepodařilo prokázat tvorbu komplexů mezi používanými mutovanými proteiny a isoformami p73 beta a delta. Při použití buněčné linie H1299-RGC stabilně transfekované reportérovým genem pro Beta-galaktosidasu pod kontrolou p53-responzivního elementu, jsme prokázali výrazné snížení hladiny transaktivace při koexpresi mutantů p53 (248Wp53 and 273Hp53) s p73 isoformou, což mohlo být způsobeno přímou interakcí těchto proteinů. Tyto ex vivo výsledky by potvrzeny v experimentu in vivo, pomocí detekce proteinů pod kontrolou p53 (MDM2 a p21) exprimovaných v tranfekované buněčné linii H1299.

Abstract:

The p53 tumour suppresor protein is critical in the control of cell growth and the maintenance of genomic stability. These activities are due, at least in part, to its ability to form homooligomers that bind to specific DNA sequences and activate transcription . The p53 homologues, p73 (encoded by TP73) and p63 (encoded by TP63), was recently indetified. Mutation in tumour suppressor p53 gene (TP53) occurs in approximately 55 % of human tumours and 95 % of these lie in the core DNA-binding domain. Some of the mutations, which markedly alter the ability of DNA binding, appear more frequently in tumours and hence they are so-called hot spot mutations. Mutated positions are involved in direct interaction with DNA or are responsible for the formation of the shape of DNA binding site. The p73 is not classical tumor supressor gene, because TP73 gene, in contrast to TP53, is rarely mutated in human cancers. The p53 and p73 proteins have a high degree of structural identity especially in DNA binding domain, TP73 gene can be translated to many p73 isoforms with different transactivation and DNA binding ability and protein-protein interaction activity. It was shown that the interaction between the tumour supressor protein p53 and the p73 protein is very weak under physiological conditions but mutated p53 proteins gain the ability to interact with p73. The reduced activity of p73 isoforms, due to interaction with mutated p53 proteins, can affect the ability of p73 to induce apoptosis in response to genotoxic agents. Our work has been focused on the study of the physical and functional interactions between mutant p53 proteins and p73 isoforms. We analysed the specificity and affinity of binding of particular mutated p53 proteins (285K p53, p53beta, 175H(P) p53 and 175(R)H p53), p73beta and p73delta isoforms and assumed complexes of mut p53/p73 to p53 responsive elements using EMSA (electromobility shift-assay). Proteins were in the form of transfected cells lysates or IVTT (in vitro transcribed/translated) proteins. It seems, that in conditions of in vitro EMSA experiments, there are not any physical interactions between chosen p53 mutated proteins and p73beta or p73delta isoforms we did not observed any complex formation. We showed, using stably transfected p53 null cell line H1299-RGC by reporter gene for Beta-galactosidase under control of p53 responsive element, the significant reduced level of transcriptional activity in coexpression of mutated p53 proteins (248Wp53 and 273Hp53) with p73beta isoform, which should be caused by direct interation between these two proteins. These results were confirmed in experiment in vivo by detection the level of proteins under p53 control (MDM2 and p21) expressed in transfected H1299 cell line. Our results indicate that the mutant 248W p53 should interact with p73beta isoform and decreased transcriptional ability of p73beta isoform in coexpression experiments

Keywords

p53, p73, apoptóza, karcinogeneze, buněčný cyklus, diferenciace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2006

Thesis defence

• Date of defence: 24. 5. 2006
• Supervisor: Mgr. Pavla Češková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry