Vliv fluorescenčního rezonančního přenosu energie na intenzitu fluorescence sledovaných znaků buněk pomocí průtokové cytometrie

Bc. Peter Slanina

Diplomová práce

Effect of the Förster resonance energy transfer on fluorescence intensity cell markers studied by flow cytometry

Abstract:

Förster resonance energy transfer is used to determine a relation between molecules at the nanometer scale. Its main purpose is to study protein and intermolecular interactions in fluorescence microscopy, flow cytometry and spectrofluorometry. This diploma thesis addresses its effect on fluorescence intensity measurements on surface markers of immune cells by flow cytometry. Theoretical part is about description of the Förster resonance energy transfer, construction and principles of flow cytometers. It also contains brief information about receptor molecules on the surface of cells, which was used for fluorescent labelling. The experimental part of the thesis covers measurements of resonance energy transfer on the cell surface receptors marked by monoclonal antibodies. The description of immune cells isolation from whole blood, labelling of these cells and whole blood by selected combinations of monoclonal antibodies conjugated with fluorescent molecules is given before the actual measurements. On the flow cytometer was carried out measurement of detectors linearity and the setting of voltages on various detectors for individual fluorochromes. The titration of monoclonal antibodies was also done. The result is statistical evaluation of fluorescence intensity of donor-acceptor pairs that are characteristic for FRET. Under specific conditions characteristic for FRET a decrease in the fluorescence intensity of donors was proved in the presence of acceptors. The consequence was false decrease in the rate of expression of the measured sign. Obtained data confirmed that Förster resonance energy transfer could influence routine measurements by flow cytometry.

Abstract:

Försterův rezonanční přenos energie se ve velké míře využívá na měření vztahů mezi blízkými molekulami (nanometrové vzdálenosti). Slouží ke studiu proteinů a mezimolekulových interakcí ve fluorescenční mikroskopii, průtokové cytometrii a spektrofluorometrii. Diplomová práce se věnuje jeho vlivu při měření intenzity fluorescence na povrchových znacích imunitních buněk průtokovou cytometrií. V teoretické části se nachází popis Försterova rezonančního přenosu energie, stavba a princip průtokového cytometru. Obsahuje také stručné informace o receptorových molekulách na povrchu buněk, které byli využité pro fluorescenční značení. Experimentální část se zaobírá samotným měřením rezonančního přenosu energie na povrchových receptorech buněk značených monoklonálními protilátkami. Měřením předchází popis izolace mononukleárních buněk z plné krve, značení těchto buněk a taky plné krve vybranou kombinací monoklonálních protilátek konjugovaných s fluorescenčními molekulami. Na průtokovém cytometru bylo provedeno měření linearity detektorů. Následně bylo titrováno optimální množství monoklonálních protilátek a nastavené napětí na jednotlivých detektorech pro příslušné fluorochromy. Výsledkem je statistické zpracování naměřených hodnot intenzity fluorescence u vybraných donor-akceptorových párů. Při splnění specifických podmínek charakteristických pro FRET bylo dokázáno snížení intenzity fluorescence donorových molekul v přítomnosti akceptorů, což mělo za následek falešné snížení míry exprese měřeného znaku. Získané údaje potvrdily možnost vlivu FRET při hodnocení dat v rutinních měřeních průtokovou cytometrií.

Klíčová slova

FRET, Průtoková cytometrie, PBMC, Monoklonální protilátky, Fluorescenční molekuly, Antigeny

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 6. 2017
• Vedoucí: Mgr. Daniel Vlk, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Fyzika / Biofyzika