Studium proteinových fosforylací pomocí hmotnostní spektrometrie

Mgr. Kateřina Hanáková, Ph.D.

Doctoral thesis

Study of protein phosphorylation by mass spectrometry

Abstract:

Fosforylace proteinu je důležitou posttranslační modifikací, která hraje roli v mnoha biologických procesech. Studium fosforylací je proto klíčové pro pochopení těchto procesů. Vhodnou metodou detekce fosforylací je hmotnostní spektrometrie, před kterou je obvykle nezbytné využít některé metody obohacení fosfopeptidů (fosfoproteinů). Tato práce se zaměřuje na využití obohacovacích metod fosfopeptidů při charakterizaci fosforylací hmotnostní spektrometrií na třech konkrétních projektech. Cílem prvního projektu bylo stanovení fosforylovaných míst proteinu MAP2c po indukci kinasou PKA a srovnání výsledků získaných hmotnostní spektrometrií a NMR spektroskopií. Pomocí obou metod jsme detekovali dvě nejintenzivnější fosforylační místa – S184 a S435. Další dva projekty byly zaměřeny na lidský protein Dishevelled, který je zapojen do Wnt signalizace. První projekt byl zaměřen na funkci Dishevelled v centrosomálním cyklu. Sledovali jsme fosforylace DVL3 a centrosomálních linkerových proteinů C-NAP1 a CDK5RAP2, indukované NEK2. Podařilo se nám identifikovat 41 fosforylovaných míst v DVL3, 82 míst v CNAP1 a 81 míst v CDK5RAP2. V dalším projektu jsme se věnovali mapování fosforylačních míst proteinu Dishevelled indukovaných osmi různými Ser/Thr kinasami. Identifikovali jsme 87 fosforylovaných serinů a threoninů (ze 131 možných) a největší relativní nárůst intenzit těchto míst byl sledován po indukci kinasami NEK2, CK1ɛ a TTBK2.

Abstract:

Protein phosphorylation is an important post-translational modification that plays a role in many biological processes. Study of phosphorylation is therefore crucial for understanding these processes. Mass spectrometry is a suitable method for the detection of phosphorylation, but it is usually necessary to use some phosphopeptide (phosphoprotein) enrichment methods before MS. This thesis focuses on the use of phosphopeptide enrichment methods in characterisation of phosphorylations by mass spectrometry within three specific projects. The aim of the first project was a determination of phosphorylated sites of MAP2c protein induced by PKA and comparison of results from mass spectrometry with NMR spectroscopy. Using both methods, we detected two most intense phosphorylation sites – S184 and S435. Two other projects were focused on the human Dishevelled protein, which is involved in the Wnt signalling pathway. The first project was focused on function of Dishevelled in the centrosomal cycle. We investigated NEK2-induced phosphorylations of DVL3 and centrosomal linker proteins C-NAP1 and CDK5RAP2. We were able to identify 41 phosphorylation sites in DVL3, 82 sites in CNAP1 and 81 sites in CDK5RAP2. In the next project we focused on mapping of phosphorylation sites induced by eight different Ser/Thr kinases. We identified 87 phosphorylated serines and threonines (out of 131 possible) and the highest relative intensity increase was observed after induction by NEK2, CK1ɛ and TTBK2 kinases.

Keywords

fosforylace, hmotnostní spektrometrie, obohacení fosfopeptidů, IMAC, MOAC, phosphorylation, mass spectrometry, phosphopeptide enrichment

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 11. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 5. 12. 2019
• Supervisor: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
• Reader: prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D., doc. RNDr. Jiří Petrák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics