Analýza proteomu pomocí nanoLC-MALDI-TOF/TOF MS a MS/MS

Mgr. Zdeněk PERUTKA

Doctoral thesis

Proteome analysis by nanoLC-MALDI-TOF/TOF MS and MS/MS

Abstract:

Hmotnostní spektrometrie ve spojení s nanoprůtokovou kapalinovou chromatografií (nLC-MS) je zavedená technika pro analýzu peptidů z komplexních směsí proteinových digestů. V této práci byla využita technika nLC MS ve spojení s ionizací a desorpcí laserem s pomocí matrice (MALDI) a komplementární analýza pomocí elektrospreje, a to pro identifikaci proteinů rozdělených gelovou elektroforézou z rozličných vzorků. Tato práce nejprve demonstruje aplikaci proteasy pseudotrypsinu, málo známé proteoformy hovězího trypsinu, nejběžněji používaného enzymu pro proteomické experimenty. Pseudotrypsin byl izolován z autolyzátu trypsinu pomocí chromatografie na kationtoměniči a následně použit pro štěpení proteinových extraktů z jader ječmene. Odlišná specifičnost pseudotrypsinu umožňující štěpení za aromatickými aminokyselinami a leucinem navíc k jeho tryptické aktivitě, vede ke vzniku unikátních peptidů a následně identifikaci odlišných proteinů při proteomických experimentech. S využitím standardu hovězího sérového albuminu a izotopově značených peptidových standardů byla srovnána účinnost štěpení připraveného pseudotrypsinu s komerčními trypsiny. V návaznosti na práci s jádry ječmene byla provedena proteomická analýza mitotických chromozomů izolovaných technikou průtokové cytometrie. Získaná data byla následně vyhodnocena pomocí bionformatických nástrojů a stanovena možná původní buněčná lokalizace nalezených proteinů a provedena jejich relativní kvantifikace. V dalším experimentu byly pomocí nLC-MS hledány proteiny a enzymy trávící tekutiny masožravé rostliny Drosery capensis. Po štěpení trypsinem nebo chymotrypsinem byly nalezeny proteiny podobné těm používaným rostlinami pro jejich obranu. Jako hlavní skupiny proteinů sekretomu rosnatky kapské byly identifikovány proteolytické enzymy a chitinasy. V nejrozsáhlejší studii zahrnuté do této práce bylo využito technik nLC-MS pro charakterizaci variability proteinového zastoupení jako možné příčiny neodstranitelného zákalu experimentálního vína připraveného z hrozna částečně napadeného Botrytis cinerea. Pro porovnání proteinových profilů SDS-PAGE a nLC-MS analýzou byly pomocí dialýzy a ultrafiltrace izolovány proteiny z komerčních bílých vín a hroznové šťávy. Proteinové zastoupení v analyzovaných vzorcích bylo následně zhodnoceno s ohledem na původ a charakteristiky vína jako pH, barva a teplotní stabilita případně viditelný zákal. Byl pozorován fenomén vysokého obsahu prolinu v proteinech nalezených v testovaných vínech. Vybrané proteiny V. vinifera s touto charakteristikou byly izolovány a otestovány, zda mohou významně přispívat k teplotní nestabilitě a vzniku zákalu vína. Tato hypotéza se nepotvrdila. Ve vzorcích vín byla nalezena opakovaně se vyskytující thiolová proteasa, která byla následně částečně charakterizována.

Abstract:

Nanoflow liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) is well established technique for analysis of complex peptide mixtures. In this work, the nLC-MS technique in conjunction with matrix-assisted laser ionization and desorption (MALDI) and complementary electrospray analysis were used to identify proteins from various kinds of samples. First, this work convincingly demonstrates the application of the protease pseudotrypsin. Pseudotrypsin was isolated from trypsin autolysate by cation exchange chromatography and subsequently used for barley nuclear proteins digestion. The cleavage specificity of pseudotrypsin allows protein hydrolysis behind aromatic amino acids and leucine in addition to its prime tryptic activity. Proteomic analysis of mitotic chromosomes isolated by flow cytometry was performed, following the work with barley nuclei. The obtained data were subsequently evaluated using bioinformatics tools. Label-free quantification of proteins was counted and possible original cellular localization of proteins was predicted. In another experiment, digestive fluids of the carnivorous plant Drosera capensis were searched for proteins and enzymes using LC-MS. Proteins similar to those produced by plants for their defense were discovered after secretome extract digestion by trypsin or chymotrypsin. As the last part, an unusual protein representation as a possible cause of experimental wine turbidity prepared from grapes partially infected with Botrytis cinerea was investigated by the nLC-MS technique. Wine proteins were isolated from commercial white wines and grape juice by dialysis and ultrafiltration. Wine protein profiles were compared by gel electrophoresis and LC-MS analysis. The protein content in the analyzed samples was evaluated with regard to the wine origin and characteristics including pH, color, temperature stability and visible haze. The frequent presence of proteins high in proline was typically observed among the tested wines. Three V. vinifera proteins with this characteristic were isolated and tested to prove they possible contribution to wine thermal instability and turbidity. This hypothesis has not been confirmed. Novel thiol protease was repeatedly found in the samples of the analyzed wines and was therefore partially characterized.

Keywords

Hmotnostní spektrometrie, identifikace proteinů, pseudotrypsin, proteasa, proteom, jaderné proteiny, chromozom, víno, zákal, Drosera, trávící šťáva, Botrytis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry