Heterologní exprese a studium vlastností enzymu polyaminoxidasy a její splicingové varianty z kukuřice

Zuzana MIČKOVÁ

Bachelor's thesis

Heterologous expression and study of properties of a polyamine oxidase and its splicing variant from maize

Abstract:

Polyaminoxidasa z kukuřice je monomerický glykoprotein, který obsahuje 1 molekulu FAD jako kofaktor. Enzym je lokalizován v buněčných stěnách semenáčku kukuřice (ve výhoncích a kořenech) a katalyzuje oxidaci polyaminů sperminu a spermidinu a jejich acetylderivátů na sekundární aminoskupině za vzniku příslušného aminoaldehydu (spontánní cyklizace), propan-1,3-diaminu a peroxidu vodíku. Zkrácená forma kukuřičné polyaminoxidasy je genová forma vzniklá z alternativního setřihu s dosud neznámou funkcí, jejíž existence byla potvrzena na úrovni mRNA. Experimentální část práce je věnována přípravě konstruktu zkrácená mPAO ve vektoru pPICZ?A, genetické transformaci kvasinek Pichia pastoris X33 tímto konstruktem a konstruktem mPAO ve vektoru pGAPZ?A a měření enzymové aktivity rekombinantních enzymů mPAO a zkrácené formy enzymu. Pomocí metody Western blot jsem prokázala, že zkrácená forma mPAO v expresním médiu zcela chybí (nebo je přítomna jen ve velice nízké, nedetekovatelné koncentraci). V expresním médiu rovněž nebyla naměřena žádná enzymová aktivita zkrácené mPAO, na rozdíl od média, ve kterém byla exprimována plná forma mPAO.

Abstract:

Polyamine oxidase from maize is monomeric glycoprotein, which contains 1 molecule of FAD as cofactor. The enzyme is localized in the cell walls of maize seedlings (in shoots and roots) and catalyzes the oxidation of polyamines spermine and spermidine and their acetyl-derivates at the secondary amino group to appropriate aminoaldehyde (spontaneous cyclization), 1,3-diaminopropane and hydrogen peroxide. Splicing variant of maize polyamine oxidase is the gene form with unknown function, which originates from alternative splicing. Its existence was confirmed at the mRNA level. The experimental part is devoted to the preparation of the construct coding for the short mPAO in the vector pPICZ?A, genetic transformation of yeast Pichia pastoris X33 by this construct and mPAO construct (mPAO in the vector pGAPZ?A) and measurement of enzyme activity of recombinant enzymes mPAO and short mPAO. Using Western blot method, I demonstrated, that in YPD medium, there was no detactable short form of mPAO. Accordingly, no enzymatic activity was measured in the expression medium. In contrast, significant enzymatic activity of the complete form of mPAO was demonstrated.

Keywords

polyaminoxidasa z kukuřice, alternativní sestřih kukuřičné polyaminoxidasy, genetická transformace kvasinek, Pichia pastoris X33, rekombinantní enzym, enzymová aktivita

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 7. 2012

Accessible from:: 31. 7. 2012

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Ondřej Plíhal, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry