Investigation of AGR3 protein function and mechanisms triggering its expression in cancer cell

Joanna Agnieszka Obacz, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Úvod: Anterior gradient protein (AGR) 3 je blízce příbuzným homologem proonkogenního proteinu AGR2. AGR3 je taxonomicky řazen do rodiny protein disulfid izomeráz. Přestože byla přítomnost AGR3 detekována u řady malignit, včetně nádorů mléčné žlázy, vaječníků, prostaty a jater, zůstává funkce tohoto proteinu v tumorigenezi stále ne zcela prozkoumána. Cílem předložené práce bylo popsat úlohu AGR3 v nádorové buňce, především pak mechanismy regulující hladinu AGR3, analyzovat vztah mezi proteiny AGR3 a AGR2 a stanovit prognostický význam exprese AGR3 u karcinomů mléčné žlázy. Metody: Funkce proteinu AGR3 byla studována na buněčných liniích MCF-7 a T-47D odvozených od karcinomu mléčné žlázy a H1299 odvozených od karcinomu plic, pomocí jak 2D tak i 3D modelových buněčných systémů. Vliv extracelulárního proteinu AGR3 na chování nádorové buňky byl studován pomocí monitorování buněčné proliferace v reálném čase, testu adhezivity, metody zacelování rýhy a β-galaktozidázovým testem. Interakce mezi AGR3 a AGR2 byla analyzována pomocí tzv. „proximity ligation assay“ a imunoprecipitace. Imunohistochemie a kvantitativní PCR byly využity ke stanovení AGR3 exprese u kohorty 129 primárních karcinomů mléčné žlázy. Ke statistickým analýzám včetně stanovení potenciálního prognostického významu proteinu AGR3 byly použity Fisherův test, Pearsonův chí-kvadrát test a Breslowův test. Výsledky: AGR3 přispívá k přežívání nádorových buněk během různých stresových podmínek, včetně poškození DNA, a to jak závisle, tak i nezávisle na proteinu p53. V případě sekrece tohoto proteinu do extracelulárního prostoru, AGR3 přispívá k buněčné adhezi a migraci pravděpodobně díky modifikaci signálních drah, které se významně uplatňují v nádorových buňkách. In silico analýzy odhalily, že AGR3 regulované i regulující signální dráhy se mohou podílet na regulaci buněčné proliferace, diferenciace, metastazování a celkového přežití. Dále bylo zjištěno, že protein AGR3 nejen že může přímo interagovat s proteinem AGR2, ale u řady nádorových ale i normálních tkání je jeho expresní profil velmi podobný AGR2. Immunohistochemická analýza u karcinomů mléčné žlázy potvrdila korelaci mezi AGR3 expresí a estrogenovými receptory, progesteronovými receptory a nízkým grade. Ačkoli zvýšená exprese AGR3 predikovala lepší bezpříznakové přežití, vícerozměrná statistická analýza nepotvrdila AGR3 jako nezávislý prognostický faktor. Závěr: AGR3 představuje potenciální tkáňový a sérový biomarker, který se může podílet respektive přímo ovlivňovat fenotyp nádorových buněk a s tím spojené projevy nádorového onemocnění.

Abstract:

Background: Anterior gradient protein (AGR) 3 is a highly related homologue of pro-oncogenic AGR2 and belongs to the family of protein disulphide isomerases. Although AGR3 was found in breast, ovary, prostate, and liver cancer, it remains of poorly defined function in tumourigenesis. The aim of this study was to elucidate AGR3 role in cancer and mechanisms responsible for its induction in tumour cell, to study putative AGR3-AGR2 cross-talk, and to determine the prognostic significance of AGR3 expression in breast carcinomas. Methods: AGR3 function was studied on breast carcinoma cell lines MCF-7 and T-47D and lung cancer cell line H1299 using both 2D and 3D models. The effect of extracellular AGR3 on cancer cell behaviour was assessed using Real-Time cell proliferation monitoring, detachment, wound-healing and β-galactosidase assays. The interaction between AGR3 and AGR2 was determined using proximity ligation assay and co-immunoprecipitation. Immunohistochemistry and qPCR were used to study AGR3 expression in a cohort of 129 primary breast carcinomas. Statistical analyses used for the determination of AGR3 prognostic significance included the Fisher’s exact, Pearson`s chi-square and Breslow tests. Results: AGR3 promotes survival of tumour cells upon DNA damage and microenvironmantal stresses both in p53-dependent and p53-independent manner. When secreted into extracellular space, it promotes cell adhesion and migration, possibly through the modification of tumour-associated signalling pathways. In silico analyses revealed that AGR3 upstream and downstream signalling may coordinate among others cell proliferation, differentiation, metastasis and survival. Furthermore, AGR3 directly binds to AGR2 and when compared to the latter is expressed in a similar manner in diverse carcinomas and normal tissues. Immunohistochemical analysis of breast cancer specimens showed that AGR3 expression correlated with oestrogen receptor and progesterone receptor positivity, as well as low tumour grade. Although in the whole cohort AGR3 positivity was associated with better progression free survival, the multivariate survival analysis did not found AGR3 as an independent prognostic factor for breast cancer patients outcome. Conclusions: AGR3 is a potential tissue and serum biomarker which modifies tumour-associated phenotype in a context-dependent manner.

Keywords

AGR3, AGR2, biomarker, karcinom mléčné žlázy, extracelulární protein

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 1. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 17. 2. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D., prof. MUDr. Zdeněk Kolář, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics