Analýza transgénnych línií Arabidopsis thaliana nadexprimujúcich gény kukuričnej adenozínkinázy (ZmADK) a miestne cielená mutagenéza génu ZmADK3

Bc. Barbora SLOVJAKOVÁ

Master's thesis

Analysis of Arabidopsis thaliana transgenic lines overexpressing adenosin kinase genes from Zea mays (ZmADK) and site-directed mutagenesis of ZmADK3

Abstract:

Jedným z najdôležitejších enzýmov záchrannej cesty purínov je adenozínkináza. Enzým katalyzuje fosforyláciu adenozínu za vzniku adenozínmonofosfátu, čím zabezpečuje znižovanie intracelulárnych hladín adenozínu. Ba čo viac, v porovnaní s de novo syntézou purínových nukleotidov, cesta využívajúca adenozínkinázu (ADK) šetrí energiu vďaka využívaniu purínových báz a nukleozidov pochádzajúcich z degradácie nukleotidov a nukleových kyselín. Diplomová práca je zameraná na analýzu transgénnych línií Arabidopsis thaliana, nadexprimujúcich gény kukuričnej ADK a miestne cielenú mutagenézu jednej z troch izoforiem. Multiplexová PCR bola využitá pre potvrdenie prítomnosti študovaného génu. Následne bolo k overeniu funkčnosti promótora využité GUS farbenie. K štúdiu expresie ADK bola využitá kvantitatívna PCR s reverznou transkripciou, ktorá bola porovnaná s hladinou proteínov určenou western blot analýzou. Boli pripravené tri mutantné formy jednej z izoforiem enzýmu. Afinita mutantných foriem bola potvrdená termoforézou v malom meradle a kinetické merania boli použité k určeniu špecifickej aktivity. Výsledky ukázali rozdiely v hladinách ADK medzi transgénnymi líniami Arabidopsis thaliana, a to pred aj po indukcii dexametazónom. Špecifická aktivita mutantných foriem odhalila dôležité aminokyselinové reziduá v aktívnom mieste enzýmu. Dosiahnuté výsledky sú podporené publikovanými zisteniami a môžu pomôcť ďalším štúdiám zameraným na skúmanie významu adenozínkinázy v metabolizme, prípadne jej vplyv na iné dráhy.

Abstract:

One of the most important enzymes in the purine salvage pathway is adenosine kinase. The enzyme catalyzes a phosphorylation of adenosine to form adenosine monophosphate and ensures the reduction of intracellular adenosine levels. Moreover, in contrast to the de novo synthesis of purine nucleotides, adenosine (ADK) pathway conserves energy by utilizing purine bases and nucleosides produced by the turnover of nucleotides and nucleic acids. The focus of this diploma thesis is the analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines overexpressing the maize ADK genes and site-directed mutagenesis of one of its three isoforms. Multiplex PCR was used to confirm the presence of the studied gene. Later, the promoter function was verified using GUS staining. Quantitative reverse transcription PCR was utilized to study ADK expression, which was correlated with protein levels confirmed by western blot analysis. Three mutant variants of one maize ADK were prepared. Their affinities were confirmed by small-scale thermophoresis and kinetic measurements used to determine specific activity. Results showed differences in ADK levels between transgenic Arabidopsis thaliana lines both before and after induction with dexamethasone. Specific activity measurements revealed important amino acid residues in the active site of the enzyme. The results are supported by published findings and may help in further studies aimed at investigating the importance of adenosine kinase in metabolism or its influence on other pathways.

Keywords

Adenozínkináza, ADK, SAM cyklus, recyklácia purínov, vektory, inducibilná expresia

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2024

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. David Kopečný

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry