Genetická transformace hub z řádu Hypocreales

Mgr. Michaela KRÁLOVÁ

Doctoral thesis

Role of fungus-borne phytohormones in the virulence process of plant pathogens from order Hypocreales

Abstract:

Abstrakt Houby z rodů Claviceps a Fusarium patřící do říše Hypocreales infikují zejména rostliny včetně ekonomicky významných plodin, jako jsou ječmen, pšenice a žito. Tato práce je zaměřena na námelovou houbu Claviceps purpurea, která v pozdějším stádiu infekce tvoří sklerocia obsahující vysoké množství námelových alkaloidů, sekundárních metabolitů, které našly uplatnění ve farmaceutickém průmyslu. Kromě C. purpurea, tato práce pojednává také o houbách z rodu Fusarium, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, a Fusarium oxysporum f. sp. medicaginis které způsobují růžovění klasů obilovin, korunní hnilobu, hnilobu kořenů či Fusariové vadnutí. Navíc se v infikovaných částech rostliny tvoří toxické sekundární metabolity, například zearalenon, trichotheceny a fumonisiny. První část této práce je zaměřena na houbu C. purpurea a její transformaci s cílem získat mutanty se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů. Za tímto účelem byly v houbě C. purpurea P1, která produkuje alkaloidy v submerzních kulturách, exprimovány geny kódující WT formu a Trp-rezistentní formu podjednotky anthranilát synthasy a gen kódující dimethylallyltryptofan synthasu fúzovaný s gfp. Následně byly v získaných mutantech měřeny primární a sekundární metabolity včetně námelových alkaloidů. Aby bylo potvrzeno, že TrpE opravdu kóduje funkční podjednotku anthranilát synthasy, byl v houbě C. purpurea 20.1, jejíž genom byl sekvenován, tento gen deletován; zároveň byl připraven komplementant. U obou získaných mutantů byla popsána Trp auxotrofie a jejich infekčnost na rostlinách žita. Druhá část této práce je zaměřena na nový nástroj pro úpravu genomu CRISPR/Cas9. Pomocí této metody byly v C. purpurea úspěšně mutovány geny pyr4 kódující orotidin 5´-fosfát dekarboxylasu a TrpE kódující podjednotku anthranilát synthasy. Navíc byla účinnost CRISPR/Cas9 metody porovnána s účinností dvou dalších metod, homologní delece zprostředkované CRISPR/Cas9 a delece založené na homologní rekombinaci. V případě hub s mutací v TrpE, byly u všech získaných mutantů sledovány Trp auxotrofie a jejich infekčnost na rostlinách žita. Třetí část této práce pojednává o genetické transformaci hub z rodu Fusarium, F. graminearum, F. pseudograminearum, a F. oxysporum f. sp. medicaginis. Všechny tyto houby byly transformovány zeleným (gfp) a červeným (dsRED nebo mCherry) markerovým genem. F. oxysporum f. sp. medicaginis bylo geneticky transformováno poprvé. Získaní mutanti budou použity na mikroskopické studie interakcí těchto patogenů s rostlinami.

Abstract:

Abstract Fungi from the genus Claviceps and Fusarium belonging to the order Hypocreales parasite predominantly on plants including economically important crops such as barley, wheat, and rye. This work is focused on ergot fungus Claviceps purpurea, that produces in the late stages of infection sclerotia containing high amount of ergot alkaloids, secondary metabolites used in pharmacy. In addition to C. purpurea, this work also deals with three fungi from the genus Fusarium, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, and Fusarium oxysporum f. sp. medicaginis that cause Fusarium head blight, crown rot, root rot, and wilting. Moreover, toxic secondary metabolites such as zearalenone, trichothecenes, and fumonisins are formed during the infection. The first part of this thesis is focused on C. purpurea and its transformation to obtain fungal mutants with increased ergot alkaloid production. Thus, genes encoding WT form and Trp-resistant form of -subunit of anthranilate synthase, and dimethylallyltryptophan synthase fused with gfp were expressed in C. purpurea strain P1 that produces ergot alkaloids in submerged cultures. Later, primary and secondary metabolites including ergot alkaloids were measured in all obtained C. purpurea P1 transformants. Moreover, to confirm that TrpE really encodes a functional -subunit of anthranilate synthase, knock-out mutant of this gene and complemented strain were prepared in genome-sequenced C. purpurea strain 20.1. In both mutants, Trp auxotrophy and pathogenicity on rye plants were described. The second part of this thesis is focused on a new genome editing technology called CRISPR/Cas9. Using this method, two genes pyr4 and TrpE encoding orotidine 5´-phosphate decarboxylase and -subunit of anthranilate synthase, respectively were successfully targeted in C. purpurea. Moreover, the transformation efficiency of this method was compared to those obtained from CRISPR/Cas9-mediated HDR and the classical gene knock-out approach based on HR. In the case of fungi with a mutation in TrpE Trp auxotrophy and pathogenicity on rye plants were assessed. The third part of this thesis deals with the transformation of three different fungi from the genus Fusarium, F. graminearum, F. pseudograminearum, and F. oxysporum f. sp. medicaginis. All fungi were transformed with green (gfp) and red (dsRED or mCherry) reporter marker genes. Moreover, F. oxysporum f. sp. medicaginis infecting Medicago plants was genetically transformed for the first time. Obtained fungi will be used for the microscopic study of plant-pathogen interactions.

Keywords

Claviceps purpurea, CRISPR/Cas9, námelové alkaloidy, dimethylallyltryptofan synthasa, podjednotka antranilát synthasy, uridin 5´fosfát dekarboxylasa, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium oxysporum f. sp. medicaginis, gfp, mCherry, dsRED

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 3. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2021
• Supervisor: prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry