Testování moderních léčiv na buňkách chronické lymfocytární leukémie s abnormalitami genů TP53 a ATM

Bc. Olga Böhmová

Master's thesis

Testing of modern drugs on chronic lymphocytic leukemia cells with aberrations of TP53 and ATM genes

Abstract:

Chronická lymfocytární leukémie je velmi heterogenní onemocnění, na jehož průběh má vliv celá řada prognostických faktorů. Aplikací cílené chemoterapie je snaha ireverzibilně poškodit DNA nádorové buňky a tím ji nasměrovat do apoptózy. CLL buňky však vyvíjejí obranné mechanismy, jak apoptóze uniknout, např. zvýšenou opravou poškozené DNA. Stěžejním cílem této diplomové práce bylo testování zamezení oprav dvouřetězcových zlomů, iniciovaných nukleosidovým analogem fludarabinem, pomocí specifického inhibitoru DNA-PK (NU7026). In vitro testování viability buněk bylo provedeno u celkem 45 CLL vzorků, z toho 15 vzorků neslo aberace v genu TP53, 15 vzorků deleci genu ATM a 15 vzorků nevykazovalo žádnou z těchto vysoce rizikových abnormalit. Testování poskytlo informace, jak CLL buňky v těchto vybraných skupinách reagují na působení samotného fludarabinu, samotného inhibitoru a kombinaci inhibitoru s fludarabinem. Byla pozorována značně heterogenní odpověď buněk na působení samotného fludarabinu, přičemž nejrezistentnější chování vykazovala skupina vzorků s aberacemi genu TP53 v porovnání se skupinami vzorků s delecí ATM a wt. Působení samotného inhibitoru kinasy DNA-PK taktéž mělo na CLL buňky velmi různorodý účinek a opětovně byl pozorován rozdíl mezi vybranými skupinami vzorků – kultury s defekty TP53 vykazovaly výrazně nižší citlivost v porovnání se dvěma zbylými studovanými skupinami. Po aplikaci inhibitoru s fludarabinem došlo u 30 % všech testovaných CLL vzorků ke statisticky významnému prohloubení účinku samotného fludarabinu, přičemž polovina z těchto senzitivizovaných vzorků nesla abnormality v genu TP53. Užitím metody western blottingu byla detekována jasná indukce proteinu p53 po aplikaci fludarabinu u všech studovaných vzorků s wt-p53. U buněk ošetřených inhibitorem NU7026 v kombinaci s fludarabinem však byla patrná výrazně nižší stabilizace p53 ve srovnání se samotným fludarabinem. Z toho lze vyvodit, že kinasa DNA-PK se podílí na fosforylaci a tedy i stabilizaci proteinu p53 a že zablokování této kinasy proběhlo úspěšně. Dále byla monitorována indukce významných p53-závislých downstream genů pomocí real-time PCR, avšak zde nebyl zaznamenán žádný rozdíl v míře indukce těchto genů u skupiny vzorků ošetřených fludarabinem a inhibitorem s fludarabinem.

Abstract:

Chronic lymphocytic leukemia is a heterogenous disease, whose course is influenced by a number of prognostic factors. Use of targeted chemotherapy aims at irreversible DNA damage of cancer cell, which should lead to apoptosis. However, CLL cells develop mechanisms of resistance to escape the apoptosis, e.g. by using accelerated DNA repair. A key aim of this diploma thesis was to test an inhibition of dsDNA break repair initiated by a nucleoside analog fludarabine, using a specific DNA-PK inhibitor (NU7026). In vitro testing of cell viability was performed in 45 CLL samples; 15 of them harbored a defect in TP53 gene, 15 manifested deletion of ATM gene and 15 samples did not have any of those high-risk abnormalities. The testing provided informations how the CLL cells react to fludarabine on its own, inhibitor on its own and a combination of these two agents. A quite heterogenous response to fludarabine was observed, with the TP53-defected subgroup showing the most resistant behaviour in comparison with the ATM-deleted and wt samples. An administration of the DNA-PK inhibitor also resulted in a heterogenous response and again a difference between the tested subgroups was observed, i.e. the cultures with the TP53 defects exhibited a lower sensitivity. Thirty percent of the CLL cultures were sensitized by the inhibitor to fludarabine, with a half of these samples harboring a TP53 defect. Using western blotting, a clear induction of the p53 protein was observed in all studied samples, which harbored wt-p53. The cells treated with inhibitor NU7026 in combination with fludarabine manifested a lower p53 induction in comparison with fludarabine alone. It may lead to conclusions that DNA-PK participates in p53 phosphorylation and a subsequent stabilization and, at the same time, that the kinase was blocked successfully in our experiments. An induction of the p53-downstream target genes was also monitored, but in this case no difference was observed between the cells treated by fludarabine and the drug combined with the inhibitor.

Keywords

CLL, p53, ATM, in vitro testování, reparace DNA, fludarabin, inhibitor DNA-PK (NU7026), in vitro testing, DNA repair, fludarabine

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 4. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2010
• Supervisor: doc. Mgr. Martin Trbušek, Dr.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry