Kapilární separační metody v analýze metabolomu a složitých biologických matricí

Bc. Filip Duša, Ph.D.

Master's thesis

Capillary separation methods in analysis of metabolome and complex biological matrixes

Abstract:

Účinně rozseparovat komplexní směs látek je velmi důležitým předpokladem k dalšímu výzkumu chemických individuí obsažených ve směsi. K tomuto účelu bylo vyvinuto velké množství metod umožňujících analyty rozdělit podle jejich fyzikálně-chemických vlastností. Jedním z významných činitelů v komplexních biologických vzorcích jsou peptidy. V teoretické části práce je podán souhrn metod použitých pro jejich efektivní rozdělení, příp. kombinací těchto metod, jejich výhod a nevýhod. V praktické části se práce zabývá účinným rozdělením směsi peptidů z tryptického digestu hovězího sérového albuminu. Pro separaci byla použita off-line kombinace IEF v rozbíhavém toku následovaná reverzně-fázovou kapilární HPLC. Ze získaných výsledků byla sestrojena 2D vrstevnicová mapa zobrazující jednotlivé peptidy ve formě úzkých proužků. Pro potvrzení účinnosti separace byla dále využita metoda mikro kapalinové chromatografie s v laboratoři vyrobenou monolitickou kapilární kolonou na silikagelové bázi. Frakce z této kolony bylo možné díky nízkému průtoku ručně nakapat na MALDI destičku a následně proběhla detekce pomocí MALDI-TOF-TOF hmotnostního spektrometru.

Abstract:

Efficient separation of complex mixture is very important for further research of substances presented in mixture. Whole spectrum of methods which allowed to separation of analytes according to its physically-chemical properties was developed in this case. Peptides are one of the main components in complex biological samples. Review covering present methods used for separations of peptides, their combinations and advantages or disadvantages is presented in the theoretic part of a diploma thesis. The practical part involves development of method for an efficient separation of peptide mixture originated from tryptic digest of bovine serum albumin. Offline combination of divergent-flow IEF and RP-capillary-HPLC was used for separation of digest. Colored contour 2D map with peptides displayed in form of narrow bands was produced from acquired data set. Separation efficiency of introduced technique was demonstrated using μLC with laboratory made silica-based monolithic capillary column. Individual fractions was deposited by hand on MALDI plate and detected with MALDI-TOF-TOF mass spectrometer.

Keywords

peptidy, 2D separace, orthogonalita, DF-IEF, HPLC, μLC, MALDI-MS

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2010
• Supervisor: RNDr. Vladislav Kahle
• Reader: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry