Analýza konformačně specifické interakce chaperonu Hsp70 s kochaperonem Tomm34

Mgr. Michal Ďurech, Ph.D.

Disertační práce

Analysis of conformation-specific interaction of Hsp70 chaperone with Tomm34 cochaperone

Anotace:

Proteiny Hsp70 představují důležitou součást chaperonového systému, který pomáhá udržovat integritu a funkčnost buněčného proteomu. Tyto proteiny jsou schopny vázat velké množství peptidových substrátů pomocí substrát-vazebné domény (SBD), která rozeznává krátkou hydrofobní sekvenci přítomnou ve většině buněčných proteinů. Vazba a následná disociace substrátu je závislá na ATP-indukovaném alosterickém pohybu Hsp70, při němž dochází k přepínání mezi ATP-vázanou a ADP-vázanou konformací. Vazba a hydrolýza ATP je proto nezbytná pro in vitro a in vivo chaperonovou aktivitu proteinů Hsp70. Aktivita a funkce Hsp70 je dále řízena interakcí s rozmanitou skupinou proteinů, tzv. kochaperonů. Řada kochaperonů obsahuje ve své struktuře TPR doménu, která představuje vazebné místo pro C-koncové struktury proteinů Hsp70. Tato práce se zabývá strukturní a funkční analýzou konformačně specifické interakce lidského cytosolického proteinu Hsp70 s TPR kochaperonem Tomm34. Protein Tomm34 specificky rozeznává ATP-vázanou konformaci Hsp70 a ovlivňuje chaperonovou aktivitu in vitro. Metodou HDX a mutační analýzou bylo definováno interakční rozhraní, které tvoří TPR1 doména s linkerovou oblastí kochaperonu Tomm34 a α helikální C koncové struktury spolu s flexibilním EEVD motivem chaperonu Hsp70. Pomocí strukturních mutantů Hsp70 byly dále studovány alosterické mechanizmy doprovázející ATP-indukovanou konformační změnu nutnou pro efektivní vazbu proteinu Tomm34. Další část práce je věnována studiu ATP-dependentní dimerizace chaperonu Hsp70. Bylo zjištěno, že vazba ATP nejenom indukuje alosterické změny ve struktuře Hsp70, ale tyto změny navíc vedou k jeho dimerizaci. Mutační analýzou a gelovou permeační chromatografií bylo potvrzeno stejné rozhraní dimerizace jako u bakteriálního homologu DnaK, které je tvořeno α helikální subdoménou SBDα jedné podjednotky a nukleotid-vazebnou doménou druhé podjednotky dimeru Hsp70. Poslední část práce je zaměřena na analýzu stechiometrie komplexů chaperonu Hsp70 s TPR kochaperony Tomm34, Chip a Hop a na studium jejich vlivu na stabilitu ATP dependentního dimeru Hsp70. Dosažené výsledky popisují nový model interakčních vztahů, jimiž chaperony a kochaperony navzájem spolupracují. Jelikož je nadměrná aktivita chaperonů a zvýšená exprese kochaperonů, včetně proteinu Tomm34, spojována s procesem kancerogeneze, poznatky popsané v této práci mohou být využity při návrhu inhibitorů chaperonového systému jako potenciálních protinádorových léčiv.

Abstract:

Hsp70 proteins represent central components of the chaperone system that helps to maintain the integrity and functionality of the cellular proteome. Hsp70s bind to a large variety of peptide substrates through their substrate binding domain (SBD) that recognizes short hydrophobic sequence present in most cellular proteins. The cycle of substrate binding and release is driven by ATP-induced allosteric changes to Hsp70, when Hsp70 switches between ATP-bound and ADP-bound states. Thus, ATP binding and hydrolysis are essential in vitro and in vivo for the chaperone activity of Hsp70 proteins. Hsp70 activity and function is further controlled by its interaction with a divergent group of proteins, the so-called cochaperones. Many cochaperones contain a TPR domain, which represents the binding site for Hsp70 C-terminal structures. This thesis focuses on the structural and functional analysis of a conformation-specific interaction between human cytosolic Hsp70 and the TPR domain containing cochaperone Tomm34. Tomm34 specifically recognizes the ATP-bound conformation of Hsp70 and influences its chaperone activity in vitro. The interaction interface formed by the TPR1 domain plus the linker region of Tomm34 and the α helical C terminal structures including the flexible EEVD motif of Hsp70 were defined by HDX and mutational analysis. Next, Hsp70 structural mutants were produced to study chaperone conformational dynamics induced by ATP binding. The next part of this thesis investigated ATP-dependent dimerization of Hsp70. It was found that ATP binding not only induces allosteric changes in Hsp70 structure, but also promotes chaperone dimerization. A similar dimerization interface to that of the bacterial homolog DnaK was confirmed by mutational analysis and gel permeation chromatography. This interface is formed by the α-helical SBDα subdomain of one Hsp70 subunit and the nucleotide binding domain of the second Hsp70 subunit. The final part of the thesis focuses on analysis of the stoichiometry of Hsp70 chaperone complexes with TPR cochaperones Tomm34, Chip and Hop and their influence on the stability of the Hsp70 ATP-dependent dimer. These data provide novel insights into the mechanisms through which chaperones and cochaperones interact and function. Given the increased activities of chaperones and the increased expression of co-chaperones in human cancers, including increased Hop and Tomm34 levels that associate with prognosis, the findings have implications for using chaperone inhibitors for cancer therapeutics.

Klíčová slova

molekulární chaperon, Hsp70, alosterie, konformace, TPR doména, kochaperon, Tomm34, HDX, molecular chaperone, allostery, conformation, TPR domain, cochaperone

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 9. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 21. 10. 2016
• Vedoucí: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc.
• Oponent: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr., MVDr. Juraj Kopáček, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie