Vliv způsobu aktivace oocytů prasete na intracelulární distribuci izoforem NO-syntázy.

Bc. Michaela Faitová

Master's thesis

Effect of porcine oocyte activation mode on intracellular distribution of NO-synthase isoforms

Abstract:

Aktivace oocytu je složitý proces zahrnující prolomení druhého meiotického bloku, exocytózu kortikálních granul a dokončení druhého meiotického dělení. Oocyt je aktivován penetrující spermií. V in vitro podmínkách je však fertilizace u prasat na rozdíl od jiných hospodářských zvířat stále málo účinná z důvodu vysoké polyspermie. Jednou z možností, jak zvýšit produkci in vitro embryí u prasat, je partenogenetická aktivace oocytů. Tu je možné navodit pomocí umělých stimulů, mezi které patří i donory oxidu dusnatého (NO). NO je molekula volného plynu, která plní funkci důležitého biologického posla v organismu. NO je syntetizován z L-argininu pomocí enzymu syntázy oxidu dusnatého (NOS). NOS se nachází v různých typech buněk a tkání a existuje ve třech izoformách (neuronová-nNOS, endoteliální-eNOS, indukovatelná-iNOS), které se od sebe liší svojí lokalizací, způsobem aktivace a funkcí. NOS a NO hraje klíčovou roli i v regulaci reprodukčních procesů včetně období růstu a zrání savčích oocytů. NO je zapojen i do regulace procesu aktivace oocytu, avšak přesný mechanismus této regulace není zcela objasněn a není zřejmé, zda nemůže být ovlivněn i způsobem aktivace. Cílem diplomové práce bylo lokalizovat jednotlivé izoformy NO-syntázy (nNOS, eNOS, iNOS) v prasečích oocytech imunocytochemickou metodou za účelem ověření hypotézy, že intracelulární distribuce jednotlivých izoforem není závislá na způsobu aktivace prasečích oocytů. V oocytech prasete byly lokalizovány všechny tři izoformy NOS. Izoforma nNOS byla v oocytech v metafázi II (MII) lokalizována zejména v korové oblasti. Po aktivaci oocytu byl zaznamenán fluorescenční signál nNOS též v prvojádrech a v cytoplazmě v okolí prvojader. eNOS byla zaznamenána zejména v cytoplazmě a v oblasti meiotického vřeténka oocytů v MII. Po aktivaci vykazovaly partenogeneticky aktivované oocyty i zygoty velmi slabý imunofluorescenční signál eNOS. iNOS byla lokalizována zejména v korové oblasti oocytů v MII i v aktivovaných oocytech. V zygotách se protein vyskytoval též v cytoplazmě v okolí prvojader. Rozdíl v lokalizaci jednotlivých izoforem NOS mezi partenogeneticky aktivovanými oocyty a zygotami nebyl zaznamenán. Z výsledků vyplývá, že způsob aktivace oocytu prasete nemá vliv na intracelulární distribuci jednotlivých izoforem NOS.

Abstract:

Oocyte activation is a complex process involving exit from the second meiotic block, cortical granules exocytosis and the completion of the second meiotic division. The oocyte is activated by sperm penetration. In porcine, in vitro fertilization is not very effective due to high polyspermy, with respect to other species. The parthenogenetic activation (PA) is possibility to increase in vitro production of embryos in pigs. PA can be induced by artifical stimuli, including nitric oxide (NO) donors. NO is a molecule of free gas and acts as an important molecular messenger. NO is synthesized from L-arginine through the action of nitric oxid synthase (NOS). NOS is found in a variety of cell types and exists in three isoforms (neuronal-nNOS, endothelial-eNOS, inducible-iNOS). These isoforms differ in their localization, function and activation signal. NOS and NO play a key role in the regulation of reproductive processes including growth period and maturation of mammalian oocytes. NO is involved in the regulation of oocyte activation, however the exact mechanism of this regulation is not fully understood. It is not clear, if the mechanism could be influenced by the method of activation. The aim of this thesis was localized the different NOS isoforms (nNOS, eNOS, iNOS) in porcine oocyte using immunocytochemical method to verify the hypotesis that intracellular distribution of NOS isoforms are not dependent on the oocyte activation mode. In porcine oocyte were localized all three NOS isoforms. nNOS isoform was localized mainly in the cortex area in MII oocytes. After oocyte activation, nNOS fluorescence signal was noticed also in pronucleus and the cytoplasm near pronuclei. eNSO isoform was localized particularly in the cytoplasm and the meiotic spindle in MII oocytes. After oocyte activation, eNOS immunofluorescence signal was very low in the parthenogenetically activated oocyte and zygotes. iNOS was detected mainly in the cortex area in both of MII oocytes and activated oocytes. The protein occured also in the cytoplasm near pronuclei in zygotes. The difference in the localization of NOS isoforms between parthenogenetically activated oocyte and zygote were not reported. These results indicate that the activation method of of porcine oocyte does not effect the intracellular distribution of NOS izoforms.

Keywords

oocyt, aktivace, IVF, NOS, prase

Keywords

IVF, activation, NOS, porcine, oocyte

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Animal Science / Special Animal Raising