Optimalizace alternativních přístupů exprese lidských isoforem karbonických anhydráz

Bc. Daniela Mozolová

Bachelor's thesis

The optimization of alternative expression approaches of human isoforms of carbonic anhydrases

Abstract:

Karbonické anhydrázy jsou fylogeneticky rozšířená skupina metaloenzymů, které katalyzují reverzibilní hydrataci oxidu uhličitého. Kromě regulace pH, se účastní metabolických drah uhlíku a bioenergetických procesů buňky. Aktivita některých lidských isoenzymů je také spojena s patologickými stavy. Lidské karbonické anhydrázy IX (hCAIX) a XII (hCAXII) jsou nadměrně exprimovány nádorovými buňkami, zabezpečují jim výhodu při proliferaci v hypoxických a acidických podmínkách rakovinové tkáně. V rekombinantní formě se karbonické anhydrázy nejčastěji exprimují pomocí bakterií Escherichia coli. Získání výtěžků o dostatečné koncentraci a čistotě, je však často složité, kvůli špatnému skládání těchto membránových proteinů a jejich ukládání do inkluzních tělísek. V této práci se jako alternativní metody exprese pro produkci konstruktů lidské karbonické anhydrázy II, IX a XII, využily eukaryotické kvasinky rodu Pichia pastoris a cell-free expresní systém.Exprese v kvasinkách byla optimalizována na základě kultivačních a expresních podmínek, metod zpracování vzorků a jejich purifikace. Cell-free exprese byla optimalizována na základě koncentrace zinku v reakční směsi, způsobu přípravy plazmidu a purifikaci vzorků. Pro purifikované proteiny byla také ověřována jejich identita a biofyzikální vlastnosti. Exprese v buňkách Pichia pastoris vedla k nízkému výtěžku. Jako vhodnější varianta se tedy projevila cell-free exprese. Obě metody vyžadují další optimalizaci.

Abstract:

Carbonic anhydrases are a phylogenetically widespread family of metalloenzymes, that catalyze the reversible hydration of carbon dioxide. Aside from pH regulation, they participate in metabolic pathways of carbon and bioenergetics of the cell. The activity of certain human isoenzymes has been connected to pathological states. Human carbonic anhydrase IX (hCA IX) and XII (hCA XII) are overexpressed in tumor cells and provide a proliferative advantage in hypoxic and acidic conditions of cancerous tissue. As recombinant proteins, carbonic anhydrases are mostly expressed in Escherichia coli. The acquisition of hCA IX and hCA XII samples of sufficient concentration and purity is often challenging, due to the misfolding of these membrane proteins and their enclosure into inclusion bodies. In this thesis, the eukaryotic yeast Pichia pastoris and cell-free expression system were used as alternative forms of expression,for the production of hCA II, hCA IX, and hCA XII constructs. Expression was optimized in yeast cells based on the cultivation and expression conditions, sample processing, and purification methods. Optimizations in the cell-free system were based on the zinc concentration, plasmid preparation technique, and protein purification. The identity and biophysical properties of the purified proteins were analyzed. As expression in Pichia pastoris led to low protein yields, cell-free expression appears more suitable, however, both methods require further optimizations.

Keywords

Karbonické anhydrázy, Cell-free, Pichia pastoris, Exprese, Purifikace, nanoDSF, CD, DLS, MALDI-TOF MS, Carbonic anhydrases, Expression, Purification

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 26. 6. 2024
• Supervisor: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Reader: Mgr. Tomáš Brom

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry