Nové molekulární mechanismy zapojené v modulaci signálních drah cytokinu TRAIL a receptorů smrti u nádorových buněk prostřednictvím chemoterapeutických látek.

Mgr. Barbora Šafaříková, Ph.D.

Disertační práce

Novel molecular mechanisms involved in modulation of TRAIL/death receptor-mediated signaling in cancer cells by chemotherapeutic drugs.

Anotace:

TRAIL (ligand indukující apoptózu, patřící do rodiny faktoru nekrotizujícího nádory) je jedinečný cytokin, který selektivně indukuje smrt u maligních, ale ne normálních buněk. Interakce TRAILu s receptory smrti DR4 a DR5 vede k vytvoření komplexu DISC (signální komplex indukující smrt), aktivaci kaspázy-8 a efektorových kaspáz. Často je vyžadováno zesílení apoptotického signálu pomocí aktivace mitochondriální dráhy, která je regulována proteiny rodiny Bcl-2. Vzhledem k tomu, že monoterapie založená na cytokinu TRAIL se často zdá být k úplnému zastavení nádorového růstu a indukci buněčné smrti nedostatečná, je studováno mnoho chemoterapeutických látek, které by mohly zcitlivět odolné nádorové buňky k jeho působení. Chemoterapeutika jako jsou cisplatina (CDDP) nebo 5-fluorouracil (5-FU) jsou běžně využívána v protinádorové terapii, avšak jejich uplatnění je komplikováno řadou vážných vedlejších účinků u normálních tkání a rezistencí nádorů. Platinový derivát LA-12 s atomem platiny v oxidačním čísle (IV) je lipofilní komplex schopný překonat rezistenci k apoptóze u některých typů nádorových buněk, neboť v řadě případů prokázal silnější protinádorové účinky ve srovnání s cisplatinou. Dosud však nejsou dostatečně objasněny molekulární mechanismy o působení těchto chemoterapeutik, zejména s ohledem na jejich schopnost modulovat signální dráhy spojené s cytokinem TRAIL a receptory smrti. V naší práci jsme proto zkoumali účinky a možné molekulární mechanismy zodpovědné za posílení apoptózy indukované cytokinem TRAIL prostřednicvím platinového derivátu LA-12 u lidských nádorových buněk prostaty a tlustého střeva a srovnávali je s účinky cisplatiny. Také jsme zkoumali cytotoxické působení 5-FU u nádorových buněk kolonu, především s ohledem na jeho schopnost ovlivnit apoptózu indukovanou přes receptor smrti DR5 a související signální dráhy. Ukázali jsme, že CDDP a LA-12 účinně zcitlivěly lidské nádorové buňky prostaty a kolonu k působení cytokinu TRAIL prostřednictvím stimulace mitochondriální dráhy, což dokazuje zvýšená aktivace proteinů Bax a Bak, pokles mitochondriálního membránového potenciálu a aktivace kaspázy-9, a dále jsme zkoumali zapojené signální dráhy u obou typů nádorových buněk. U nádorových buněk prostaty jsme po aplikaci CDDP/LA-12 a cytokinu TRAIL dále pozorovali zvýšenou aktivaci proteinu Bid, kaspázy-8, -10 a -3 a štěpení proteinu XIAP. Ukázali jsme, že v těchto buňkách je pro společné cytotoxické působení látek klíčový protein Bid. Také jsme nově prokázali, že platinové látky posilují buněčnou smrt indukovanou cytokinem TRAIL prostřednictvím pozitivní zpětnovazebné aktivace mitochondriální dráhy závislé na proteinech Bid a Bak, která dále vede k zvýšené aktivaci kaspázy-8, ale již ne k dalšímu posílení štěpení proteinu Bid. Pro společné cytotoxické působení kombinace látek není nezbytně nutné zapojení kaspázy-10. Nově jsme ukázali, že látka LA-12 je schopna posílit apoptózu indukovanou cytokinem TRAIL u nádorových buněk odvozených ze vzorků prostatické nádorové tkáně pacientů. Nádorové buňky kolonu dále reagovaly na působení LA-12 a cytokinu TRAIL zvýšením množství protenů Noxa a BimL. Látka LA-12 indukovala aktivaci kinázy ERK a následné zvýšení exprese proteinu c-Myc, který byl klíčový pro aktivaci mitochondrií pomocí proteinů Bax/Bak a posílení buněčné smrti. Prokázali jsme také, že toxické účinky kombinace CDDP/LA-12 a cytokinu TRAIL nejsou závislé na proteinu p53 a dále jsou posíleny umlčením exprese proteinu Mcl-1 pomocí specifické siRNA. Navíc jsme pozorovali, že kombinace látek je schopna účinně eliminovat nádorové buňky odvozené z různých stádií vý

Anotace:

voje kolorektálního karcinomu a zároveň není toxická pro buňky odvozeného z normálního epitelu tlustého střeva. Studovali jsme také molekulární mechanismy zodpovědné za cytotoxické účinky 5-FU u nádorových buněk kolonu, se zaměřením na signální dráhu spojenou s receptorem smrti DR5. Již dříve jsme ukázali, že cytotoxické působení 5-FU je spojeno s akumulací DR5 na plasmatické membráně, formací komplexu DISC a aktivací kaspáz. Dále jsme se zaměřili na možné vzájemné interakce apoptózy a autofagie indukované působením 5-FU. Narušení apoptózy na úrovni komplexu DISC nebo mitochondrií neovlivnilo schopnost 5-FU indukovat autofagii u buněk s wt p53, avšak pozorovali jsme deregulaci autofagie u buněk deficientních pro p53 protein. Inhibice ranných fází autofagie pomocí chemických inhibitorů nebo umlčením exprese regulátorů autofagie prostřednictvím specifických siRNA neovlivnila buněčnou smrt indukovanou 5-FU, naopak blok pozdních fází autofagie ji výrazně omezil. Tyto výsledky naznačily, že v cytotoxickém působení 5-FU se uplatňuje spíše úloha lysozomů než samotný proces autofagie. Poškození lysozomální funkce vedlo k relokalizaci DR5 na membrány lysozomů a autofagozomů. Narušení transportu mezi endoplazmatickým retikulem a Golgiho aparátem nebo funkce cholesterolu oslabilo účinky 5-FU. Ukázali jsme tedy, že cytotoxické působení 5-FU je v nádorových buňkách kolonu zprostředkováno přes DR5 a může být ovlivněno prostřednicvím lysozomů a transportu cholesterolu. Originální výsledky prezentované v této práci přinášejí nové poznatky o úloze chemoterapeutických látek v modulaci signálních drah cytokinu TRAIL a receptoru smrti DR5, především s ohledem na zapojení mitochondriální apoptotické dráhy, funkci lysozomů a vnitrobuněčný transport DR5. Naše poznatky mohou přispět k lepšímu pochopení protinádorových vlastností a terapeutického potenciálu zmíněných chemoterapeutik v kombinaci s cytokinem TRAIL.

Abstract:

TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) is a unique cytokine that selectively activates apoptotic signaling in malignant but not in normal cells. Interaction of TRAIL with its death receptors DR4 and DR5 results in death-inducing signaling complex (DISC) formation, followed by caspase-8 activation and subsequent effector caspases activation. The amplification of apoptotic signal via mitochondrial pathway may often be required, which is tightly regulated by Bcl-2 family proteins. As TRAIL monotherapy appeared to be often not sufficient to fully inhibit the tumor growth and induce cell death, numerous chemotherapeutic drugs have been tested as potential sensitizers of resistant cancer cells to TRAIL-induced apoptosis. Chemotherapeutics such as cisplatin (CDDP) or 5-fluorouracil (5-FU) are conventionally used in anticancer therapy but their application is complicated by serious side effects on normal tissues and the tumor resistance. The platinum(IV) adamantylamine ligand-containing complex LA-12 is recently introduced lipophilic platinum complex capable to overcome apoptosis resistance in some cancer cells, and exert higher antitumor activity compared to cisplatin. Nevertheless, detailed molecular mechanisms of the anticancer action of these chemotherapeutic drugs are still not completely understood, especially with regard to their ability to modulate TRAIL/DR5-mediated pathways and related signaling. In present work, we investigated the mechanisms responsible for LA-12-mediated enhancement of TRAIL-induced apoptosis in human prostate and colon cancer cells, and compared them with those exerted by CDDP. Futhermore, we explored the cytotoxic effects of 5-FU on cancer cells with respect to its ability to influence DR5-mediated apoptotic signaling, and associated molecular mechanisms. We demonstrated that pretreatment with cisplatin or LA-12 effectively sensitized human prostate and colon cancer cells to TRAIL-induced apoptosis via an engagement of mitochondrial pathway, as documented by enhanced Bax and Bak activation, drop of mitochondrial membrane potential, and activation of caspase-9, and further explored the related signaling in both cancer cell types. In prostate cancer cells treated with CDDP/LA-12 and TRAIL, we observed an enhanced activation of Bid, caspase-8, -10 and -3, and XIAP cleavage. We showed that in these cells, Bid is a key molecule for the cooperative cytotoxic action of the drugs. We also newly demonstrated that platinum-based drugs potentiated TRAIL-mediated cell death through Bid/Bak-dependent positive mitochondrial feedback amplification loop connected with an enhanced caspase-8 processing, but not with further increase in Bid cleavage. Next, we proved that caspase-10 was dispensable for the cooperative effects of CDDP/LA-12 and TRAIL. Moreover, we firstly documented the ability of LA-12 to potentiate TRAIL-induced apoptosis in cancer cells derived from prostate tumor specimens obtained from human patients. The colon cancer cells further responded to LA-12 and TRAIL application by ERK-mediated upregulation of Noxa and BimL proteins. Importantly, we showed that LA-12 pretreatment also resulted in ERK-mediated upregulation of c-Myc that was crucial for Bax/Bak-mediated mitochondria activation, and subsequent enhancement of cell death. We also demonstrated that observed killing effects of CDDP/LA-12 and TRAIL combination were p53-independent, and augmented by the siRNA-mediated silencing of Mcl-1. Moreover, we documented that combination of drugs efficiently eliminated cancer cells derived from various stages of colon cancer development, while at the same time was not harmful to the cells derived from normal human colon epithelium. Further, we studied the molecular mechanisms reponsible for 5-FU-induced cytotoxicity in colon cancer cells, with focus on DR5 signaling. We have previously demonstrated that 5-FU-mediated toxicity is connected with DR5 plasma membrane accumulation, DISC form

Abstract:

ation and caspases activation. Here we investigated possible cross-talk of apoptosis and autophagy induced by 5-FU treatment. The impairment of apoptosis at the DISC or mitochondrial level did not affect the 5-FU ability to induce autophagy in p53 wt cancer cells, while the p53 deficiency led to autophagy deregulations. Block of early phases of autophagy by chemical inhibitor or downregulation of autophagy regulators by specific siRNAs did not alter the 5-FU-generated cell death, whereas chemical inhibition of later stages reduced the cancer cells elimination. This indicated involvement of lysosomes in 5-FU-mediated cell death rather than autophagy itself. The disruption of lysosomal function led to relocalization of DR5 into the lysosomal and autophagosomal membranes. Next, abrogation of endoplasmic reticulum-Golgi transport or cholesterol trafficking impaired the cytotoxic action of 5-FU. Taken together, we showed that 5-FU-induced toxicity mediated by DR5 in colon cancer cells is associated with proper lysosomal function and cholesterol trafficking. The original results obtained in this work provide a novel insight into the importance of chemotherapeutic drug-mediated modualtion of TRAIL/DR5 signaling in cancer cells, with a particular focus on mitochondria-related apoptotic events, proper lysosomal fuction and DR5 intracellular transport. Our findings contribute to better understanding of anticancer properties and therapeutic potential of above-mentioned chemotherapeutic drugs in combination with TRAIL.

Keywords

LA-12, cisplatina, 5-FU, TRAIL, DR5, apoptóza, autofagie, nádory prostaty, nádory kolonu, cisplatin, apoptosis, autophagy, prostate cancer, colon cancer

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 1. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 2. 2018
• Vedoucí: RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D.
• Oponent: doc. Mgr. Petr Beneš, Ph.D., prof. PharmDr. Emil Rudolf, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Fyziologie živočichů