Interakce plazmidové DNA s protinádorově aktivními komplexy kovů v buňkách E. coli

Bc. Jana Štěpánková, Ph.D.

Master's thesis

Studies of interactions between anticancer active metal complexes and plasmid DNA in E.coli cells

Anotácia:

Cisplatina jako nejúčinnější chemoterapeutické léčivo reaguje s purinovými bázemi v DNA za vzniku vnitrořetězcových, meziřetězcových a monofunkčních křížových vazeb. Ačkoli se mnoho studií již zabývalo strukturou a opravou meziřetězcových křížových vazeb, zůstává biologický efekt na DNA v buňce nejasný. Pro hlubší pochopení opravy meziřetězcových křížových vazeb cisplatiny za podmínek in vivo byl využit model superhelikální plazmidové DNA v buňkách E. coli. DNA pUC19 byla transformována do dvou isogenetických kmenů WP2 wt (divoký typ), WP2 uvrA (mutace v genu UvrA) a kmene E.coli DH5a. Buňky E. coli byly inkubovány s cisplatinou. Kinetika úbytku cisplatiny v supernatantu buněk E. coli byla sledována pomocí diferenční pulsní polarografie. Vzorky cisplatinou modifikované plazmidové DNA byly izolovány. Množství platiny na DNA bylo určeno pomocí atomové absorpční spektrometrie (AAS). Meziřetězcové křížové vazby cisplatiny byly detekovány pomocí alkalické denaturační elektroforézy. Pro získání podrobnějších informací o buněčných procesech probíhajících během reparace plazmidové DNA, byly E. coli kmeny inkubováné s cisplatinou a následně reinkubovány v čerstvém LB médiu. Z buněk byly vyizolovány vzorky plazmidové DNA a byla sledována přítomnost meziřetězcových křížových vazeb.

Abstract:

Cisplatin is a widely used chemotherapeutic agent. This drug reacts with purine bases in DNA and forms intrastrand crosslinks, interstrand crosslinks and monofunctional adducts. Although there have been a number of investigations on the structure and repair of interstrand crosslinks, the extent to which they form in cellular DNA and their possible biological effects remain unclear. To better understrand how interstrand cross-links are repaired in vivo was used the intracellular model of plasmid DNA and host E. coli cells treated with cisplatin. DNA pUC19 was transfected into set of two isogenic E. coli strains WP2 wt (wild type), WP2uvrA (UvrA mutant) and strains E. coli DH5a (recA mutant). E. coli cells with plasmid pUC19 were treated with cisplatin. Kinetics of reaction cisplatin with E. coli cells was measured by the differential pulse polarographic methods. Samples of plasmid DNA were isolated. The amount of platinum on the DNA was measured by atomic absorption spectrometry (AAS). The DNA was also analyzed by alkaline gel electrophoresis (detected DNA interstrand crosslinks of cisplatin). To obtain more detailed information about cellular processing during repair of plasmid DNA, cisplatin treated cells of E. coli strains were prolonged incubated in the fresh LB media. Cells were harvested and samples of repaired plasmid DNA were prepared and tested on the presence of interstrand crosslinks.

Kľúčové slová

DNA pUC19, cisplatina, Escherichia coli, WP2, WP2uvrA, DH5a, meziřetězcové křížové vazby DNA pUC19, cisplatin, interstrand crosslinks

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 5. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2007
• Vedúci: RNDr. Marie Vojtíšková, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Physics / Biophysics