Použití metod bioafinitní chromatografie ke studiu nespecifické sorpce a kvantifikace ligandu

Bc. Lucie Švehlová

Diplomová práce

Methods of bioaffinity chromatography used for study of non-specific sorption on carrier and for quantification of ligand

Anotace:

Cílem práce bylo připravit modelový bioafinitní systém použitelný k izolaci specifického ligandu a použít jej ke studiu míry nespecifické sorpce biomolekul a kvantifikaci ligandu. Interagujícím biospecifickým párem byl modelový antigen chymotrypsin a anti-chymotrypsinové protilátky. Zdrojem specifických protilátek bylo odsolené hyperimunní prasečí sérum. Izolace a purifikace byla provedena nespecifickou metodou iontově výměnné chromatografie, a dále specifickými metodami s využitím proteinu A nebo chymotrypsinu kovalentně vázaného k nosiči. Protilátky byly poté imobilizovány na magnetické částice s různými funkčními skupinami (-COOH, -NHNH2, -SH), a to neorientovaným i orientovaným způsobem. Takto zhotovené imunosorbenty byly využity k izolaci afinantu - chymotrypsinu. U připravených imunosorbentů byla studována úspěšnost imobilizace protilátek, k tomu byly použity metody SDS-PAGE, spektrofotometrická, bioafinitní se specifickou protilátkou značenou enzymem (tzv. konjugát). Další charakterizací zhotovených imunosorbentů bylo jejich využití k izolaci afinantu-chymotrypsinu. U připravených imunosorbentů byla studována nespecifická sorpce. Jako nejúčinnější se jevila inkubace s 1% BSA. Specifické metody vykazovaly větší stupeň adsorbovaných proteinů.

Abstract:

The aim of this work was to prepare a model bioaffinity system for the isolation of the specific ligand and use it for studying the intensity of a non-specific sorption of the biomolekul and the quantification of ligand. The complementary biospecific pair was a model antigen chymotrypsin and anti-chymotrypsin antibodies. The source of the specific antibodies was a desalting hyperimmune pig's serum. The isolation and the purification was done by a non-specific method of the ionexchange chromatography, then with a specific method by using protein A or chymotrypsin coupled covalently to particles. Then the antibodies were coupled to the magnetic particles with the different functional groups (-COOH, -NHNH2, -SH), namely by a non-oriented and an oriented way. The immunosorbents prepared in this way were studied afterwards for the efficient immobilization of the antibodies by using SDS-PAGE electrophoresis, the spectrophotometry, the bioaffinity with the specific antibody marked by the enzyme socalled conjugate. Another characterization of the immunosorbents was its application for the isolation of affinant-chymotrypsin. The immunosorbents were studied for blocking of a non-specific sorption. The most efficient blocking agent was a solution of 1% BSA. Other specific blocking methods embodyed higher degree of a non-specific sorption of proteins.

Klíčová slova

Bioafinitní systém, ligand, chymotrypsin, anti-chymotrypsinové protilátky, imobilizace, imunosorbent, konjugát, SDS-PAGE elektroforéza, nespecifická sorpce.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 5. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 6. 2008
• Vedoucí: Mgr. Marcela Slováková, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů