Charakterizace vybraných jaderných proteinů rostlin: Opravy poškození DNA u rostlin s malým a velkým genomem

Jovanka VLADEJIĆ

Doctoral thesis

Charakterizace vybraných jádrových proteinů rostlin

Abstract:

The survival and reproduction of organisms rely on the maintenance of genetic information stability, ensuring the continuity of the species. DNA damage due to external and internal sources represents a significant risk in preserving the integrity of the genome. To mitigate the risk of DNA changes, eukaryotes evolved a system to safeguard genomic stability called the DNA damage response (DDR) (Britt, 1996). While the DDR is evolutionarily conserved across species, distinct features can be observed across different kingdoms. Plants, for instance, have a highly integrated DDR, likely attributed to their sedentary nature, which prevents them from escaping unfavorable conditions (Hays, 2002). Most plant DDR research focuses on Arabidopsis thaliana, a great model in plant genetics due to its small genome and rosette-like chromosome organization. However, less is known about DDR in plants with larger genomes, like crops which are plants of higher economic value. Barley, with its large genome and Rabl chromosomal organization, serves as an ideal model for cereals. The size of a genome influences how DNA is organized in the nucleus, and this chromatin structure impacts all DNA-related processes. This is why the research presented here used both Arabidopsis and barley as model organisms. The research into Arabidopsis DDR proteins culminated in the characterization of a novel protein involved in homologous recombination repair. The initial candidate selection was guided by the knowledge that DDR proteins often feature BRCT domains that recognize phosphorylated substrate (Leung and Glover, 2011), and drew on homology to the BRCT5 domain in animals. From the sensitivity assays using various genotoxic chemicals, one candidate protein stood out, and was selected for further testing - BCP1. Further analysis revealed that DNA damage induces BCP1 expression, and its expression is controlled by the DDR master regulator, SOG1. To help extend knowledge on DDR in barley, a novel technique for testing barely mutants' sensitivity to DNA-damaging chemicals has been established as part of this research. Then the response of barley wild type and the ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED AND RAD3-RELATED (ATR) mutant plants to DNA damage was examined using this protocol. The activation of the DNA damage response network was analyzed by conducting transcriptome analysis via RNA sequencing on both wild-type and ATR mutant plants. Additionally, a comprehensive list of potential barley homologs of known Arabidopsis DDR proteins was compiled, including SOG1 and its related transcription factors that aided transcriptomic data analysis.

Abstract:

Přežití a rozmnožování organismů závisí na zachování stability genetické informace, která zajišťuje kontinuitu druhu. Poškození DNA vlivem vnějších a vnitřních zdrojů představuje významné riziko v zachování integrity genomu. Pro zmírnění rizika změn DNA se u eukaryot vyvinul systém pro zajištění stability genomu, který se nazývá odpověď na poškození DNA (DDR) (Britt, 1996). Ačkoli je DDR evolučně konzervovaná napříč druhy, lze pozorovat odlišné rysy napříč různými říšemi. Například rostliny mají vysoce rozvinuté mechanismy DDR, což lze pravděpodobně přičíst tomu, že se nemohou pohybovat a protocož jim brání uniknout nepříznivým podmínkám (Hays, 2002). Většina výzkumu DDR u rostlin se zaměřuje na Arabidopsis thaliana (huseníček rolní), který je díky svému malému genomu a rozetovému uspořádání chromozomů skvělým modelem v rostlinné genetice. Méně je však známo o DDR u rostlin s většími genomy, jako jsou např. obiloviny, které mají vyšší ekonomickou hodnotu. Ječmen se svým velkým genomem a Rablovým uspořádáním chromozomů slouží jako ideální model pro studium molekulárních mechanismů u obilovin. Velikost genomu ovlivňuje způsob uspořádání DNA v jádře a tato struktura chromatinu ovlivňuje všechny procesy související s DNA. Proto zde prezentovaný výzkum použil jako modelové organismy jak huseníček rolní, tak ječmen. Výzkum proteinů zapojených v DDR u Arabidopsis vyústil v charakterizaci nového proteinu, který se podílí na opravě pomocí homologní rekombinace. Původní výběr kandidátů byl veden poznatkem, (Leung and Glover, 2011). na základě homologie s BRCT5 doménou byly vybrány 4 kandidátní geny, které mohou být potencionálně důležité v DDR Z testů citlivosti s použitím různých genotoxických chemikálií vynikl jeden kandidátní protein, který byl vybrán k dalšímu testování - BCP1. Další analýza odhalila, že poškození DNA indukuje expresi BCP1 a jeho exprese je řízena hlavním regulátorem DDR, SOG1. V rámci tohoto výzkumu byla vytvořena nová technika pro testování citlivosti ječmenných mutantů k chemickým látkám poškozujícím DNA, která má pomoci rozšířit znalosti o DDR u ječmene. Pomocí tohoto protokolu pak byla zkoumána reakce divokého typu ječmene a mutantních rostlin ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED AND RAD3-RELATED (ATR) na poškození DNA. Aktivace sítě reakce na poškození DNA byla analyzována provedením analýzy transkriptomu pomocí sekvenování RNA u divokého typu i mutantních rostlin ATR. Kromě toho byl sestaven komplexní seznam potenciálních homologů známých proteinů DDR z huseníčku rolního pro ječmen, včetně SOG1 a jemu příbuzných transkripčních faktorů, který napomohl analýze transkriptomických dat.

Keywords

Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare, ječmen, obiloviny, BRCT, homologní rekombinace, ATR, SOG1, BCP1, transkritomika

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 3. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 15. 5. 2024
• Supervisor: prof. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology