Možnosti zvýšení fertilizační schopnosti inseminačních dávek vyrobených pro účel umělé inseminaci ovcí

Bc. Lucie Langerová

Master's thesis

Possibilities of increasing the fertilization capacity of insemination doses produced for the purpose of artificial insemination of sheep

Abstract:

Cílem diplomové práce bylo na základě dostupné literatury definovat specifické látky, které měly pozitivní vliv na motilitu spermatických buněk, byly testovány u jiných druhů hospodářských zvířat nebo člověka a otestovat tyto látky v experimentálním modelu beraního ejakulátu. V této práci byl testovanou látkou inhibitor fosfodiesterázy ibudilast. Pracovní roztok se připravil rozředěním této látky v DMSO. Vznikla tak koncentrace 100 mM. Ejakulát se získal od čtyř beranů plemene valašská ovce. Pro výrobu vzorků se vždy použil odběr plemeníka, který splňoval všechny požadavky na minimální kvalitu ejakulátu. Ejakulát byl následně ředěn ředidlem OptiXcell, a poté se sperma rozdělilo do zkumavek. K prvním třem vzorkům byly přidány tři rozdílné objemy ibudilastu, rozředěného v DMSO (0,5, 1, 2 µl). Finální koncentrace testovaného enhanceru motility byly v těchto objemech 50, 100 a 200 µM. K dalším třem vzorkům se přidaly tři rozdílné objemy čistého DMSO, které odpovídaly objemům ibudilastu s DMSO (0,5, 1, 2 µl). Ve vzorcích tak vznikla 0,05, 0,1 a 0,2% koncentrace DMSO. Poslední vzorek byl kontrolní, tedy bez přidaných látek. Po naplnění do pejet probíhala 2 hodiny ekvilibrace, a poté se vzorky zmrazily. Po rozmrazení ve vodní lázni probíhala analýza pomocí systému pro hodnocení motility CASA ve dvou časech, a to ihned po rozmrazení a 3 hodiny od začátku rozmrazování. Pozitivní vliv na celkovou a progresivní motilitu (p<0,05) měl v obou měřených časech DMSO o koncentraci 0,05 %, ve srovnání s 50 µM ibudilastem a kontrolou. U koncentrací DMSO 0,1 a 0,2 % se statisticky významný vliv na celkovou a progresivní motilitu projevil pouze v čase 3 hodiny od začátku rozmrazování. Výsledky zde ukazují na účinnou kryoprotektivní i antioxidační ochranu DMSO, která se projevuje při nízkých koncentracích. Ibudilast o koncentraci 50 μM pozitivně ovlivnil celkovou motilitu (p<0,05) v čase měření 3 hodiny od rozmrazení oproti kontrole. Tento jev byl pozorován i u 100 a 200 μM. Vliv na progresivní motilitu ve srovnání s kontrolou nebyl statisticky prokázán (p>0,05). Výsledky dále ukazují dobré působení ibudilastu na kinematické parametry motility a lineární pohyb. Zde byl prokázán statisticky významný pozitivní vliv (p<0,05) na zvýšení rychlosti těchto parametrů u všech tří konečných koncentrací (50, 100, 200 μM) v čase ihned po rozmrazení. Měření po 3 hodinách od rozmrazení nepotvrdilo statisticky významný rozdíl mezi těmito třemi variantami ibudilastu a variantami DMSO, i kontrolou (p>0,05). Pro zrychlení pohybu spermií, tedy hyperaktivaci, je důležité zvýšení hladiny cAMP. Inhibitory fosfodiesterázy blokují hydrolýzu cAMP, čímž jeho hladina roste. To potvrzují i výsledky naší práce, kdy ibudilast průkazně zvýšil hodnoty kinematických parametrů, tzn. průměrnou rychlost dráhy, křivočarou rychlost a lineární rychlost (μm/s) u beraních spermií. Díky těmto výsledkům máme předpoklady pro zlepšení kvality inseminačních dávek a tím i fertilizační schopnosti. Je však vhodné tyto předpoklady ověřit in vivo, metodou polního testu.

Abstract:

The aim of the diploma thesis was to define, specific substances that had a positive effect on the motility of sperm cells, were tested in other species of livestock or humans, and to test these substances in an experimental model of ram ejaculate. The tested substance was the phosphodiesterase inhibitor ibudilast. The working solution was prepared by diluting this substance in DMSO. This resulted in a concentration of 100 mM. The ejaculate was collected from four rams of the wallachian sheep. We always used the collection of semen, which met all the requirements for the minimum quality of the ejaculate for the production of samples. The ejaculate was diluted by OptiXcell diluent, and then the sperm were separated into tubes. Three different volumes of ibudilast diluted in DMSO (0.5, 1, 2 µl) were added to the first three samples. The final concentrations of the tested motility enhancer in these volumes were 50, 100 and 200 µM. Three different volumes of pure DMSO were added to the other three samples, corresponding to the volumes of ibudilast with DMSO (0,5, 1, 2 µl). This resulted in 0,05, 0.1 and 0,2% DMSO concentrations in the samples. The last sample was a control, i.e. without added substances. Equilibration took place for 2 hours, and then the samples were frozen. Analysis was performed using the CASA motility assessment system at two times, immediately after thawing and 3 hours after the start of thawing. DMSO at a concentration of 0,05% had a positive effect on motility and progressive motility (p<0,05) at both measured times, compared to 50 µM ibudilast and the control. DMSO concentrations of 0,1 and 0,2%, was manifested statistically significant effect on total and progressive motility only within 3 hours from the start of thawing. The results here show the effective cryoprotective and antioxidant protection of DMSO, which is manifested at low concentrations The results further show a good effect of ibudilast on the kinematic parameters of motility and linear movement. Here is a statistically significant positive effect (p<0,05). The high level of cAMP is important for hyperactivation of sperm motility. Phosphodiesterase inhibitors block the hydrolysis of cAMP. This is also confirmed by the results of our work, when ibudilast significantly increased the values of kinematic parameters, i.e. average trajectory velocity, curvilinear velocity and linear velocity (μm/s) in ram spermatozoa. Thanks to these results, we have the prerequisites for improving the quality of insemination doses. However, it is advisable to verify these assumptions in vivo, using the field test method.

Keywords

beran, motilita, spermie, CASA, enhancer motility

Keywords

ram, motility, sperm, CASA, motility enhancer

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 4. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 21. 5. 2024
• Supervisor: Ing. Filipp Georgijevič Savvulidi, Ph.D.
• Reader: Andrea Svoradová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology