Role povrchového náboje elicitinu cryptogeinu při indukci rezistence

Bc. Elena Babuliaková

Diplomová práce

The role of cryptogein surface charge to resistance induction

Abstract:

Elicitins are small holoproteins which are secreted by the oomycete of genus Phytophthora and several species of genus Pythium. They induce on a wide variety of plants systemic acquired resistance involving the activation of defense genes, synthesis of pathogenesis-related (PR) proteins or accumulation of phytoalexins (capsidiol). They are divided into acidic and basic elicitins. While acidic α-elicitins (pI<7) have 2-4 lysine residues and cause less necrosis, basic β-elicitins (pI>7) have 6 positively charged lysine residues and cause more extensive necrosis associated with a higher resistance. The aim of the thesis was to design the mutations of lysine residues on the surface of the basic elicitins cryptogein in order to reduce necrotic activity while maintaining resistance. In the thesis by using the method of site-directed mutagenesis there have been created mutant forms of cryptogein K48T, K39T/K94T, K61T/K62T and K39T/K48T/K94T with modified surface charge. After application into the tobacco leaves, the expression of defense genes PR1a, PR2Q, GLN2, PR3Q and PR5 was determined by using of RT-qPCR. For all mutants, the ability to induce the synthesis of fytoalexin capsidiol was observed. All used mutants were able to induce necrosis and synthesis of capsidiol. However, accumulation of transcripts for each mutant varied greatly. While application of the mutants K48T and K39T/K48T/K94T induced approximately the same accumulation of measured transcripts compared to cryprogein, application of the mutants K61T/K62T and K39T/K94T led to a significant decrease of some transcripts of genes compared to cryptogein. Measured data show that mutant forms K39T/K94T and K61T/K62T have probably reduced ability to induce local resistance. Further, the measured data confirm expected effect of positive lysine residues to their biological activity. However, it was found that the impact of individual residues and their mutual combinations on the activity is likely to be very different.

Abstract:

Elicitíny sú malé holoproteíny (10 kDa) sekretované oomycetami rodu Phytophthora a niekoľkými druhmi Pythium indukujúce na celej rade rastlín systémovú rezistenciu zahŕňajúcu aktiváciu obranných génov, syntézu pathogenesis-related (PR) proteínov alebo akumuláciu fytoalexínov (kapsidiolu). Sú rozdelené na kyslé a bázické elicitíny. Zatiaľ čo kyslé α-elicitíny (pI<7) majú 2-4 lyzínové zvyšky a spôsobujú nižšiu nekrózu, bázické β-elicitíny (pI>7) majú 6 kladne nabitých lyzínových zvyškov a vyvolávajú roziahlejšiu nekrózu spojenú s vyššou rezistenciou. Cieľom diplomovej práce bolo prevedenie mutácií lyzínových zvyškov na povrchu bázického elicitínu kryptogeinu za účelom zníženia nekrotickej aktivity za súčasného zachovania rezistencie. V diplomovej práci boli vytvorené mutantné formy kryptogeinu K48T, K39T/K94T, K61T/K62T a K39T/K48T/K94T so zmeneným povrchovým nábojom metódou miestne riadenej mutagenézy. Po aplikácii na listy tabaku sa stanovila expresia obranných génov PR1a, PR2Q, GLN2, PR3Q a PR5 pomocou RT-qPCR. Pri všetkých mutantoch bola ďalej sledovaná schopnosť vyvolať syntézu fytoalexínu kapsidiolu. Všetky použité mutanty boli schopné vyvolať nekrózu a syntézu kapsidiolu. Akumulácia transkriptov u jednotlivých mutantov sa však výrazne líšila. Aplikácia mutantov K48T a K39T/K48T/K94T viedla k približne rovnakej akumulácii sledovaných transkriptov ako po aplikácii kryprogeinu, zatiaľ čo aplikácia mutantov K61T/K62T a K39T/K94T viedla k signifikantnému poklesu niektorých transkriptov génov. Mutantné formy K39T/K94T a K61T/K62T majú pravdepodobne zníženú schopnosť indukovať lokálnu rezistenciu. Namerané dáta tak ukazujú na predpokladaný vplyv kladných lyzínových zvyškov elicitínov na ich biologickú aktivitu. Ukázalo sa však, že vplyv jednotlivých zvyškov a ich vzájomných kombinácií na aktivitu sú zrejme veľmi rozdielne.

Klíčová slova

kryptogein, cryptogein, elicitíny, elicitins, obranné mechanizmy rastlín, plant defense reaction, PR proteíny, Pathogenesis-related proteins, kapsidiol, capsidiol, fytoalexíny, phytoalexins

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 6. 2013
• Vedoucí: doc. Mgr. Tomáš Kašparovský, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie