Proteinové inženýrství pro studium strukturně-funkčních vztahů enzymů

Mgr. Veronika Lišková, Ph.D.

Doctoral thesis

Protein engineering for analysis of structure-function relationships of enzymes

Abstract:

Enzymy jsou přírodní biokatalyzátory vynikající vysokou efektivitou a specifitou. Díky těmto vlastnostem jsou enzymy využívané v mnoha biotechnologických odvětvích. Na rozdíl od chemických katalyzátorů, běžně se vyskytující enzymy neumožňují přeměnu nepřirozených substrátů nebo katalýzu reakcí probíhajících za extrémních či jinak nepřirozených podmínek. Tato disertační práce odhaluje komplexní vztahy mezi sekvencí enzymů, jejich strukturou a funkcí pomocí metod proteinového inženýrství pro získání funkčních enzymů v náročných podmínkách. Práce také poskytuje detailní přehled technik řízené evoluce, racionálního a semi-racionálního designu jako hlavních metod používaných pro inženýrství proteinů. Výsledková část práce zahrnuje tři studie zaměřené na hydrolytické enzymy z rodiny halogenalkandehalogenas (HLD). HLD štěpí vazbu mezi uhlíkem a halogenem v širokém spektru halogenovaných alkanů, což umožňuje jejich využití v mnoha biotechnologických aplikacích. Biotechnologické využití HLD je limitováno jejich nízkou odolností vůči průmyslovým podmínkám, jako je např. vysoká teplota nebo použití organických rozpouštědel. Kapitola 1 je zaměřena na inženýrství vysoce stabilní avšak málo aktivní varianty HLD DhaA prostřednictvím semi-racionálního designu. Konstrukce chytré knihovny měnící dvě (V172 a F176) ze čtyř aminokyselin v ústí vstupního tunelu za všechna stabilizující residua, a jedné knihovny saturující pouze pozici F176 poskytly novou variantu. Tato varianta se sice lišila od vysoce stabilní čtyřbodové varianty DhaA pouze jednou změnou (F176G), avšak vykazovala 32x a 10x zvýšenou aktivitu v pufru, respektive ve 40% DMSO při ztrátě pouhých 4 °C ze své stability. Strukturní a počítačové analýzy ukázaly, že zatímco mutace F176G zvýšila katalytickou aktivitu zvětšením poloměru ústí tunelu a mobility přilehlých α-helixů lemujících tunel, zbývající tři mutace v ústí tunelu udržovaly stabilitu. Tato studie ukazuje, že optimalizací poloměru a dynamiky vstupních tunelů enzymu lze dosáhnout křehké rovnováhy mezi stabilitou a aktivitou. Kapitola 2 poukazuje na hydrataci enzymů jako na významný faktor v enzymové katalýze ovlivňující skládání jejich struktury, kinetiku, interakce s ligandy včetně dalších proteinů nebo DNA a také enantioselektivitu. Předchozí studie zabývající se hydratací specifických částí HLD enzymů DbjA a DhaA využila časově rozlišenou fluorescenční spektroskopii a molekulovou dynamiku. Enzymy DbjA a DhaA jsou charakteristické velmi odlišnou enantioselektivitou, která je pravděpodobně způsobena odlišnou hydratací jejich aktivních míst a přístupových tunelů. Cílem Kapitoly 2 bylo prozkoumat hydrataci aktivních míst HLD DbjA a DhaA začleněním fluorescenční nepřirozené aminokyseliny (UAA) do ústí tunelů obou enzymů. Fluorescenční spektroskopie měřená ve stacionárním stavu potvrdila, že mikroprostředí obklopující UAA v DhaA je méně hydratované než v DbjA. Využití vysoce enantioselektivních enzymů je velmi účinný způsob syntézy opticky čistých látek pro farmaceutický, potravinářský a chemický průmysl. Pro racionální design selektivních katalyzátorů je důležité pochopení molekulární podstaty interakcí probíhajících mezi enzymem a substrátem vedoucí k enantiodiskriminaci. Kapitola 3 objasňuje molekulární podstatu enantiodiskriminace 2-brompentanu enzymy DbjA, DhaA a DhaA31. Na rozdíl od neselektivní DhaA, vykazují DbjA i DhaA31 výbornou enantioselektivitu vůči 2-brompentanu. DbjA obsahuje široké a hydratované aktivní místo, zatímco varianta DhaA31 má více uzavřené a méně hydratované aktivní místo než neselektivní DhaA. Systematické studium molekulární podstaty enantioselektivity s

Abstract:

využitím termodynamických a kinetických analýz, místně-cílené mutageneze a molekulového modelování odhalilo dva odlišné mechanismy. Enantioselektivita DhaA31 pochází ze sterické bariéry vzniklé začleněním dvou specifických substitucí v aktivním místě a přístupovém tunelu, zatímco enantioselektivita DbjA souvisí s hydratací aktivního místa.

Abstract:

Natural enzymes are highly efficient and versatile biocatalysts applicable in various fields. However, unlike chemical catalysts, natural enzymes are not used to catalyze non-natural reactions in artificial environment. Thesis uncovers a highly complex relationship between enzyme's sequence, its structure, and its function by the usage of protein engineering techniques. Moreover, a comprehensive overview of directed evolution, rational and semi-rational design methods as main techniques of protein engineering is provided. The three studies described in the results section of the Thesis are focused on hydrolytic enzymes haloalkane dehalogenases (HLDs). HLDs catalyze the cleavage of a carbon-halogen bond in a wide range of halogenated alkanes making them suitable biocatalysts for various biotechnological applications. Biotechnological usage of HLDs is limited by their low resistance to harsh conditions such as elevated temperatures and organic co-solvents. Chapter 1 aimed to enhance the catalytic activity of highly stable but poorly active HLD DhaA variant using a semi-rational design. Construction of one smart library targeting two (V172 and F176) of the four tunnel-mouth residues by all possibly stabilizing residues and one library saturating a single position 176 led to the identification of new DhaA variant. The resulting variant differed from the stable four-point DhaA variant in only a single residue (F176G) but exhibited 32- and 10-times enhanced activity in the buffer and 40 % DMSO, respectively, sacrificing only 4 °C of the thermal stability. Structural and molecular dynamics analyses showed that whereas F176G enhanced the catalytic activity of the enzyme by increasing the radius of the tunnel's mouth and the mobility of the adjacent α-helices lining the tunnel, remaining three access tunnel mutations keep its stability. This study shows that delicate balance between stability and activity can be achieved by fine-tuning the radius and dynamics of the access tunnels. Chapter 2 describes a hydration of enzymes as an important factor in enzymatic catalysis since hydration influences enzyme folding, kinetics, interactions with ligands, other proteins or DNA, and enantioselectivity. Novel approach how to study the hydration of specific parts of protein was applied on HLDs DbjA and DhaA exhibiting different enantioselectivity due to different hydration of their active sites and access tunnels. This conclusion was based on the data from time-resolved fluorescence spectroscopy and molecular dynamics simulations. The aim of the study was to investigate the hydration of the active site and access tunnels via site-specific incorporation of fluorescent unnatural amino acid (UAA) as a probe into the tunnel mouth of both DbjA and DhaA. Steady-state fluorescence spectroscopy analysis of UAA proved that the microenvironment surrounding the UAA in DhaA is less extensively hydrated than in DbjA. Application of highly enantioselective enzymes is a powerful way to obtain optically pure chemicals for pharmaceutical, fine and food chemical industries. Understanding the molecular basis of enzyme-substrate interactions involved in enantiodiscrimination is essential for rational design of selective catalysts. Chapter 3 is focused on the elucidation of the molecular basis of enantiodiscrimination of 2-bromopentane by DbjA, DhaA, and DhaA31. Both DbjA and DhaA31 exhibited excellent enantioselectivity when compared to non-selective DhaA. Highly enantioselective DbjA has wide-open and solvated active site, while engineered DhaA31 has more occluded and less solvated cavity. A systematic study on the molecular basis of enantioselectivity using thermodynamic and kinetic analyses, site-directed mutagenesis, and molecular modelling revealed two distinct molecular mechanisms of enantioselectivity by studied HLDs. Enantioselectivity of DhaA31 arises from steric hindrance introduced by two specific substitutions in the active site and access tunnel wher

Abstract:

eas enantioselectivity of DbjA is due to the hydration of its active site.

Keywords

protein engineering, directed evolution, semi-rational design, structure-function relationships of enzymes, haloalkane dehalogenases

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 3. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 11. 5. 2018
• Supervisor: doc. Mgr. Radka Chaloupková, Ph.D.
• Reader: prof. Mgr. Marek Šebela, Ph.D., RNDr. Lubomír Janda, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology