Detekce a stanovení proteinů 14-3-3 u pacientů s neurodegenerativním onemocněním

Hana ŠTEFANSKÁ

Bachelor's thesis

Detection and determination of 14-3-3 proteins in patients with neurodegenerative diseases

Abstract:

Úvod: Proteiny 14-3-3 se řadí mezi vysoce konzervované kyselé homologní proteiny, které se podílí na celé řadě důležitých procesů v lidském těle, např. na řízení buněčného cyklu, apoptóze, neuronálním vývoji, buněčném růstu nebo signální transdukci a fosforylaci. Skládají se ze sedmi izoforem, které se nachází ve všech eukaryotních buňkách. Nejvyšší exprese proteinů 14 3 3 je však vykazována v mozku. Z tohoto důvodu má stanovení proteinů 14-3-3 význam u pacientů s neurologickým onemocněním, převážně u rychle progredující demence s neurologickými příznaky. Cílem práce bylo zavedení metody detekce proteinů 14-3-3 do rutinní laboratorní praxe metodami ELISA a Western blot s chromogenní, popř. s chemiluminiscenční detekcí a následné testování u pacientů s neurodegenerativním onemocněním. Metodika: V této bakalářské práci byl studován soubor 55 vzorků mozkomíšního moku pacientů Neurologické kliniky FN Ostrava s podezřením na neurodegenerativní onemocnění. Soubor byl rozdělen do čtyř skupin, na pacienty s Creutzfeldt-Jakobovou chorobou, s Parkinsonovou chorobou, s demencí a pacienty bez neurodegenerativního onemocnění (kontroly). Proteiny 14-3-3 byly detekovány metodou Western blot za použití protilátek firmy Cell Signaling Technology a Santa Cruz Biotechnology. Dále byly proteiny 14-3-3 stanoveny ELISA metodou za použití dvou diagnostických souprav, Human 14-3-3 Protein (MyBioSource) a CircuLex 14-3-3 Gamma (MBL). Rutinní biomarkery neurodegenerativních onemocnění, T-Tau, P-Tau a ?-amyloid 1-42 byly taktéž stanoveny ELISA soupravami (Euroimmun). Výsledky: Při kvalitativním průkazu proteinů 14-3-3 byly optimální výsledky získány s využitím protilátek Anti-pan 14-3-3 Antibody a Anti-15-3-3 ? Antibody firmy Santa Cruz Biotechnology. V rámci kvantitativního stanovení, diagnostická souprava CircuLex 14-3-3 Gamma oproti Human 14-3-3 Protein poskytla měřitelné výsledky. Na základě statistického zpracování dat byla zjištěna statisticky významná korelace mezi proteiny 14-3-3 gama, P Tau (p = 0,0038) a T-Tau (p = 0,0001) a mezi proteiny T-Tau a P-Tau (p = 0,0001). Dále pomocí Kruskal Wallisova testu byla prokázána statisticky významná závislost proteinu 14 3-3 gama (p = 0,003) a T-Tau proteinu (p = 0,009) na typu onemocnění. Závěr: Získaná data podporují výsledky ostatních studií. ELISA metoda na stanovení izoformy 14-3-3 gama i metoda Western blot pro detekci proteinů 14-3-3 jsou vhodné pro spolehlivou detekci proteinů 14-3-3 pro diagnostické účely Creutzfeldt-Jakobovy choroby.

Abstract:

Introduction: 14-3-3 proteins are among the highly conserved acidic homologous proteins that are involved in a number of important processes in the human body, such as cell cycle control, apoptosis, neuronal development, cell growth, or signal transduction and phosphorylation. They consist of seven isoforms found in all eukaryotic cells. However, the highest expression of 14-3-3 proteins is shown in the brain. For this reason, the determination of 14-3-3 proteins are important in patients with neurological diseases, predominantly in rapidly progressive dementia with neurological symptoms. The aim of this study was to introduce the method of detection of 14-3-3 proteins into routine laboratory practice by ELISA and Western blot with chromogenic or with chemiluminescent detection and subsequent testing in patients with neurodegenerative disease. Methods: In this bachelor thesis, a set of 55 cerebrospinal fluid samples of patients of the Neurological Clinic FN Ostrava with suspected neurodegenerative disease were studied. The set was divided into four groups, patients with Creutzfeldt-Jakob disease, Parkinson´s disease, dementia and patients without neurodegenerative disease (controls). The 14-3-3 proteins were detected by Western blot using antibodies from the Cell Signaling Technology and Santa Cruz Biotechnology. Furthermore, 14-3-3 proteins were determined by ELISA using two diagnostic kits, Human 14-3-3 Protein (MyBioSource) and CircuLex 14 3 3 Gamma (MBL). Routine biomarkers of neurodegenerative diseases, T-Tau, P-Tau and ?-amyloid 1-42 were also determined by ELISA (Euroimmun). Results: Optimal results in the qualitative detection of 14-3-3 proteins were obtained using Anti-pan 14-3-3 Antibody and Anti-15-3-3 ? Antibody from Santa Cruz Biotechnology. In the quantitative assay, the CircuLex 14-3-3 Gamma versus Human 14-3-3 Protein diagnostic kit provided measurable results. Based on statistical processing of the data, there was a statistically significant correlations between 14-3-3 gamma, P-Tau (p = 0.0038) and T-Tau (p = 0.0001) proteins and between T-Tau and P-Tau proteins (p = 0.0001). Furthermore, using the Kruskal-Wallis test, a statistically significant dependence of protein 14-3-3 gamma (p = 0.003) and T-Tau protein (p = 0.009) on disease type was demonstrated. Conclusion: The obtained data support the results of other studies. Both the ELISA method for the determination of the 14-3-3 gamma isoform and the Western blot method for the detection of 14-3-3 proteins are suitable for the reliable detection of 14-3-3 proteins for the diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease.

Keywords

ELISA, Western blot, proteiny 14-3-3, Creutzfeldt-Jakobova choroba, priony, demence

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2022

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 14. 6. 2022
• Supervisor: doc. RNDr. Pavlína Kušnierová, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Medicine

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Laboratory Assistant