Strukturní analýza pohlavních chromozomů u rodu Silene

Bc. Tereza Králová

Diplomová práce

The Structure of Sex Chromosomes in Genus Silene

Anotace:

Znalost struktury pohlavních chromozomů je nezbytnou podmínkou pro pochopení mechanismů jejich evoluce, potažmo pro pochopení vzniku a vývoje dvou odlišných pohlaví. Modelem pro studium struktury pohlavních chromozomů v rané fázi jejich evoluce se mi stala dvoudomá rostlina silenka širolistá (Silene latifolia) s morfologicky odlišitelnými pohlavními chromozomy. Cílem mé diplomové práce bylo připravit komplexní chromozomálně specifické sondy, prohledat BAC knihovnu pomocí navržených sond, analyzovat nalezené BAC klony, lokalizovat sekvence typické pro pohlavní chromozomy a provést jejich charakterizaci. Hledání pohlavně specifických sekvencí začalo tvorbou BAC knihovny Silene latifolia. Ta byla hybridizována dvěma typy sond. Jednotlivé X specifické klony byly vybírány tak, aby poskytovaly pozitivní signál se sondami z mikrodisektovaných X chromozomů a žádný signál se sondami z mikrodisektovaných autozomů. Na základě tohoto kritéria bylo překvapivě vybráno pouze 8 klonů z celkového počtu 119 808 klonů. Tyto klony byly podrobeny analýze pomocí FISH, která ukázala, že X specifické sekvence mají v rámci chromozomu repetitivní charakter. Aby bylo možné odhalit sekvence DNA charakteristické pro X chromozom (respektive pro oba pohlavní chromozomy) byl vybrán pouze jeden klon, který nejsilněji hybridizoval s X chromozomem, a to BAC86M14. Pro umožnění podrobnější analýzy bylo provedeno subklonování. Výše zmíněný BAC86M14 klon byl naštípán za použití dvou restrikčních endonukleas AluI a HaeIII. Fragmenty ligované do bakteriálních vektorů E.coli byly elektroforeticky roztřízeny podle velikosti a vybrány byly pouze fragmenty o minimální velikosti 500 bp. Zjištění hojnosti jednotlivých fragmentů v rámci samčího genomu Silene latifolia bylo provedeno pomocí kapkové hybridizace. Osmnáct, v rámci genomu nejhojnějších, subklonů bylo osekvenováno.. Při prohledání genových databází byla zjištěna výrazná podobnost většiny subklonů s BAC klonem AB257588 odvozeným z Y chromosomu. V části tohoto BAC klonu, a to v oblasti o délce 20 kb bylo lokalizováno sedm repetitivních subklonů. Pomocí anotované databáze částečně osekvenovaného genomu Silene latifolia se podařilo charakterizovat dva mobilní elementy. Element A odpovídá LTR retrotranspozonům typu Copia a je výrazně akumulovaný na chromozomu Y, zatímco element B typu Ty3/Gypsy je nejhojnější na chromozomu X. Oba elementy jsou klasifikovány jako mobilní elementy třídy I, konkrétně jde o LTR retrotranspozony, příbuzné elementům Athila a PIGY. Podrobnější analýza elementů popsaných v této práci výrazně přispěje k odhalení evolučních mechanismů formujících pohlavní chromozomy.

Abstract:

A knowledge of the structure of sex chromosomes is a necessary condition for understanding mechanisms of their evolution, as well as for understanding origin and evolution of two separated sexes. Dioecious species Silene latifolia with morphological distinct sex chromosomes is a suitable model for studying structure of sex chromosomes in early stages of their evolution. The aim of my diploma thesis was: 1.) to prepare complex chromosome-specific probes, 2.) screening the BAC library with designed probes, 3.) analysis of selected BAC clones, 4.) localization of sequences typical for individual sex chromosomes and their characterization. An initial step in the search for sex specific sequences was the construction of the Silene latifolia BAC library. BAC library was hybridized with two types of probes (X-chromosome derived and autosomes-derived). We chose 8 BAC clones (from the total number of 119 808 clones) giving positive signal with X-derived probes and no signal with autosomal probes. Selected clones were analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH results demonstrate repetitive character of X-linked sequences. To reveal DNA sequences specific for X chromosome (respectively for both, X and Y sex chromosomes), one clone BAC86M14 was selected. This clone showed the strongest hybridization signal on X chromosome. For a detailed analysis, BAC86M14 clone was digested using two restriction endonucleases AluI and HaeIII. Fragments were ligated to the bacterial vector, transformed into E. coli and separated using gel electrophoresis. Only fragments with minimal length of 500 bp were used for further analyses. Dot-blot hybridization was performed to determine the abundancy of individual fragments within the male genome of Silene latifolia. 18 most abundant subclones were sequenced. A comparison to NCBI genomic database revealed that the majority of subclones show significant similarity to Y chromosome derived BAC clone AB257588. In this BAC clone, seven repetitive subclones were localized within a 20 kb region. Using annotated Silene latifolia 454-database, enabled to characterize two mobile elements A and B. Element A corresponds to Copia-like LTR retrotransposones with a high frequent accumulation on the Y chromosome, while Ty3/Gypsy-like element B was most abundant on the X chromosome. Both elements are classified as Class I mobile elements, concretely LTR retrotransposones, related to Athila and PIGY. More detailed analysis of mobile elements characterized in this work will significantly contribute to investigate mechanisms involved in the evolution of sex chromosomes.

Klíčová slova

Pohlavní chromozomy, mobilní elementy, Silene latifolia, determinace pohlaví Sex chromosomes, mobile elements, sex determination

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 6. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 6. 2009
• Vedoucí: RNDr. Roman Hobza, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie