Molekulární interakce v metastazování low-grade nádorů prsu

Mgr. Josef Maryáš, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular interactions in low-grade breast cancer metastasis

Anotácia:

Nádory prsu (BrCa) představují heterogenní onemocnění, které je klasifikováno na základě histologických, klinických a/nebo imunohistochemických (IHC) markerů, které rovněž slouží jako prognostické a prediktivní faktory. Hlavní příčinou úmrtí pacientů s BrCa jsou však metastázy, které vznikají v procesu metastatické kaskády, multifaktoriálního a vícestupňového procesu zahrnujícího tzv. epiteliálně-mesenchymální tranzici (EMT). Je zřejmé, že metastatická kaskáda včetně EMT zahrnuje velké množství proteinů, na které lze cílit a modulovat tím proces vzniku metastáz. Disertační práce sumarizuje poznatky o proteinech PDZ and LIM domain protein 2 (PDLIM2), ring finger protein 25 (RNF25) a TRAF3 interacting protein 2 (TRAF3IP2), které byly identifikovány jako proteiny související s metastazováním do lymfatických uzlin u luminálních-A nádorů prsu pomocí kombinace proteomických a transkriptomických přístupů. Za účelem pochopení molekulární podstaty tohoto vztahu jsme se nejprve zaměřili na protein-proteinový interaktom a srovnali konvenční pull-down assay se surface plasmon resonance (SPR) čipy v kombinaci se “sequential window acquisition of all theoretical fragment ion spectra mass spectrometry” (SWATH-MS) pro identifikaci interakčních partnerů proteinu PDLIM2. Naše výsledky ukazují, že afinitní matrice a mechanismus promytí a eluce jsou kritickými kroky assaye, a ukazují SPR v kombinaci se SWATH-MS jako relevantní nástroj pro detekci protein-protein interakčních partnerů. Zadruhé, funkční potvrdily vztah proteinu PDLIM2 k EMT, hypoxii, proliferaci a adhezi nádorové buněčné linie MCF7, modelu odvozeném od luminálních-A nádorů prsu. Paralelní experimenty na imortalizovaných buňkách odvozených od normálního prsního epitelu MCF10A však odhalily jeho spíše tumor supresivní funkci, což vede k hypotéze o duální a na biologickém kontextu závislé roli PDLIM2 v procesu vzniku a vývoje nádorů prsu. Zatřetí, širokorozsahová celoproteomová analýza spojená s analýzou protein-proteinové interakční sítě, “gene set enrichment analysis” (GSEA) a analýzou migrace a invaze buněčné linie MCF7 prokázala souvislost zvýšených hladin proteinů PDLIM2, RNF25 a TRAF3IP2 s cytoskeletárními změnami, zvýšenou proliferací, migrací, invazí a s nádorovou progresí. Práce jako celek přispívá k pochopení molekulární sítě zapojené do metastazování luminálních-A nádorů prsu a jejího vlivu na fenotyp nádorových buněk.

Abstract:

Breast cancer (BrCa) is a heterogeneous disease currently classified based on histological, clinical and/or immunohistochemical (IHC) markers that also serve as prognostic and predictive factors. However, the most common cause of death of BrCa patients are metastases, which are formed during metastatic cascade, the multistep and multifactorial process involving epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). It is evident that metastatic cascade and EMT itself involve a large number of potentially targetable proteins that might modulate the process of metastasis formation. The dissertation thesis focuses on PDZ and LIM domain protein 2 (PDLIM2), ring finger protein 25 (RNF25) and TRAF3 interacting protein 2 (TRAF3IP2) which have been previously identified as proteins related to lymph node metastasis in luminal-A breast tumors using a combination of proteomic and transcriptomic approaches. To understand the molecular basis of this phenomenon, we first focused on protein-protein interactome and compared conventional pull-down assays on streptavidin agarose beads with surface plasmon resonance chips (SPR) in combination with sequential window acquisition of all theoretical fragment ion spectra mass spectrometry (SWATH-MS) to identify PDLIM2 interactors. Our results show that solid support and mechanics of wash and elution are the critical aspects of the assay, and highlight SPR with SWATH-MS as a relevant tool for the detection of PDLIM2 protein-protein interactions. Second, a series of hypothesis-driven functional experiments confirmed association of PDLIM2 with EMT, hypoxia, proliferation and adhesion of MCF7 breast cancer cell line, a model of luminal-A breast cancer. However, the parallel experiments in immortalized normal epithelial breast cells MCF10A revealed its rather tumor suppressive role, leading to the hypothesis on dual and context dependent role in breast cancer development. Third, large-scale total proteome analysis together with the analysis of protein-protein interaction network, gene set enrichment analysis (GSEA) and functional analysis of migration and invasion of MCF7 breast cancer cell line demonstrated the association of elevated PDLIM2, RNF25 and TRAF3IP2 protein levels with cytoskeletal changes, increased proliferation, migration, invasion, and tumor progression. The work contributes to understanding the molecular network involved in luminal-A breast cancer metastasis and its impact on cancer cell phenotype.

Keywords

PDLIM2, TRAF3IP2, RNF25, epiteliálně-mezenchymální tranzice, metastazování, karcinom prsu, epithelial-mesenchymal transition, metastasis, breast carcinoma

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 20. 5. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2020
• Vedúci: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Oponent: doc. Mgr. Jan Bouchal, Ph.D., RNDr. Pavel Řehulka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry