Reconstitution of recombination-associated DNA synthesis and its regulation

Mgr. Marek Šebesta, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Homologní rekombinace (HR) udržuje stabilitu genomu opravou dvouřetězcových zlomů na DNA. Tato dráha, považovaná za bezchybnou, používá homologickú sekvenci nalezenou v genomu na kopírování informace ztracené v místě dvouřetězcového zlomu. Zatímco počáteční kroky této dráhy jsou podrobně přezkoumané, molekulární mechanizmus syntézy DNA asociované s rekombinací je málo prostudovaný. Z tohoto důvodu jsme rekostituovali syntézu DNA asociovanou s rekombinací v podmínkach in vitro a zkoumali jsme vliv známých regulačních faktorů v tomto experimentálním prostředí. Testovali jsme schopnost Mph1, Srs2 a Sgs1 usměrňovat opravu dvouřetězcových zlomů směrem k větvi HR označované jako synthesis-dependent strand-annealing. V podmínkách in vitro Pol δ a Pol η extendovaly maximálně 50% substrátu tvořeného D-loop strukturou, avšak vykazovaly rozdíly v délce produktů stejně tak jako v závislosti na PCNA. Zatím co Mph1 efektívně vytěsnil extendovaný primer, Srs2 inhibovala syntézu DNA závislou na rekombinaci v přítomnosti SUMOylované PCNA. Naše výsledky odkrývají molekulární mechanizmus syntézy DNA závislé na rekombinaci tak jako na její regulaci.

Abstract:

Homologous recombination (HR) maintains genome stability by repairing DNA double-stranded breaks. It is an error-free pathway, which uses homologous sequence found in the genome to copy the missing information. While the initial steps of HR are well described, the molecular mechanisms of recombination-associated DNA synthesis, and its regulation remains poorly understood. Therefore, we reconstituted recombination-associated DNA synthesis in vitro, and studied the effect of the known regulatory factors of HR on the assay. We tested the ability of polymerase δ and η to extend D-loop substrate, and the ability of Mph1, Srs2 and Sgs1 to promote synthesis-dependent strand-annealing branch of HR. Both Pol δ and Pol η extended up to 50% of the D-loop substrate, but differed by their product length and their dependency on PCNA. While Mph1 efficiently displaced the extended primer, Srs2 inhibited recombination-associated DNA synthesis in the presence of SUMOylated PCNA. Our results give insights into the molecular mechanism of recombination-associated DNA synthesis and its regulation.

Keywords

DNA double-strand break repair, homologous recombination, DNA synthesis, PCNA, Srs2

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 4. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 28. 5. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D.
• Reader: Dr. Pavel Janscak, PhD., doc. RNDr. Karel Říha, PhD.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry