Využití moderních metod v metabolomice

Mgr. Jindra Smutná, Ph.D.

Doctoral thesis

Application of Modern Methods for Metabolome Studies

Abstract:

Kvantitativní i kvalitativní stanovení metabolitů (nízkomolekulárních produktů metabolismu) v buňce, tkáni, nebo organismu, poskytuje důležité informace o probíhajících biochemických procesech a fyziologickém stavu daného biologického systému. Předmětem poměrně nové vědecké disciplíny – metabolomiky - je pak stanovení kompletní sady intra- i extracelulárních metabolitů za definovaných podmínek, tzn. za konkrétního fyziologického stavu buňky. Výzkum v oblasti metabolomiky vyžaduje reprodukovatelné přípravy vzorku a spolehlivé analytické separační metody, které umožňují analýzu vysoce komplexních vzorků. Silnou pozici zde zaujímá kapilární elektroforéza (CE), která se díky svým rozměrům separační kapiláry vyznačuje velmi malou spotřebou vzorku a minimálními organickými odpady. CE dále umožňuje rychlé, vysoce účinné a plně automatizované analýzy s možností využití online prekoncentrace k výraznému zvýšení koncentrační citlivosti dané metody. Nukleotidy patří mezi centrální metabolity komplexní metabolické sítě buněk. Jejich stanovení má podstatný význam pro metabolomické studie, neboť jejich hladina spolu s koenzymy odráží energetický stav buňky, který je vysoce dynamický v závislosti na fyziologických podmínkách během buněčného růstu a smrti. V předložené disertační práci je vyvinut kompletní postup pro stanovení nukleotidů a koenzymů v bezbuněčném extraktu bakterie Paracoccus denitrificans, včetně rychlého zastavení metabolismu, extrakce požadovaných metabolitů, úpravy vzorku a analýzy pomocí CE v kombinaci s online prekoncentrací: zakoncentrování vzorku zesílením pole. Tento postup analýzy nukleotidů a koenzymů byl s úspěchem aplikován i na bezbuněčný extrakt kmenových buněk.

Abstract:

Quantitative and qualitative analysis of metabolites, i.e. low molecular weight products of metabolism, in a cell, tissue or in an organism provides important information on ongoing biochemical processes and physiological state of the biological system. The aim of a relatively recent scientific discipline – metabolomics – is to assess a complex set of intra- and extracellular metabolites under pre-defined conditions, i.e. under specific physiological state of the cell. In metabolomics, it is necessary to establish reproducible sample preparations and reliable analytical separation methodologies which allow for analyses of highly complex samples. One of the most frequently used methods in metabolite analyses is Capillary Electrophoresis (CE), which, due to the separation capillary size, requires very small amount of the sample and minimum organic waste. Moreover, CE disposes of a fast, highly efficient and fully automatic analysis, feasible with online pre-concentration in order to significantly increase concentration sensitivity. Nucleotides are included in central metabolites of complex metabolic net of cells. Their assessment is crucial for metabolomic studies, since nucleotides and coenzymes reflect energetic state of the cell, which is highly dynamic depending on physiological conditions during the cell growth and apoptosis. In the thesis, a complex rigorous methodology for assessment of nucleotides and coenzymes in extract of Paracoccus denitrificans is introduced, including fast quenching of metabolism, extraction of the metabolites, sample adjusting for analyses and CE analysis using online pre-concentration: field amplified sample stacking. This methodology has been successfully applied for extract of stem cells as well.

Keywords

Metabolomika, Metabolom, Kapilární elektroforéza, Nukleotidy, Koenzymy, Online prekoncentrační techniky.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 10. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 26. 11. 2014
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Juraj Ševčík, PhD., prof. Ing. Ivan Mikšík, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry