Selekce a separace buněk pomocí flowcytometrie se zaměřením na raritní monoklonální gamapatie

Bc. Jana FILIPOVÁ

Master's thesis

Selection and separation of cells using flow cytometry with focusing on rare monoclonal gammapathies

Abstract:

Monoclonal gammopathies (MG) are haematological malignancies, which are characterized by proliferation of clonal plasma cells (PC). Study of rare monoclonal gammopathies meets following methodological pitfalls. Sample collection and biobanking is essential step for retrospective analyses. This approach seems to be optimal to achieve relevant study cohort size. Next, sorting of target cells with high purity to avoid contamination for subsequent sensitive methods and post-sorting sample processing to reach high quality material with minimal losses for subsequent analyses. Therefore, the aim of this thesis is to set up standard operation procedure for sorting of clonal plasma cells of MG and check quality of isolated DNA/RNA for potential use for subsequent analyses. During this thesis realization, freezing/thawing protocols for routine use in biobank were successfully optimized. Vitality of cells after thawing and price of used material were the main criteria for protocol optimization. It was created and optimized protocol for FACS sorting of rare clonal PC population, including intracellular staining. This protocol, as well as instrument settings recommendation are ready to use for routine research activity in multiple myeloma, MGUS, and AL amyloidosis. From the limited amount of sorted cells, DNA and RNA were simultaneously isolated. Despite ambiguous quality control results, this protocol can be used in routine practice after further minor optimization.

Abstract:

Monoklonální gamapatie (MG) patří do hematologických malignit a jsou charakteristické proliferací klonálních plazmatických buněk. Studování raritních monoklonálních gamapatií musí splňovat následující kritéria. Sběr vzorku a biobankovnictví je základním krokem pro retrospektivní analýzy. Takový přístup se zdá být optimální pro dosažení příslušného počtu vzorků ve výzkumu. Dalším krokem je separovat cílové populace vysoké čistoty a předejít kontaminaci vzorku pro následné senzitivní metody. Posledním kritériem je zpracování vzorku po separaci s dosažením co nejvyšší kvality materiálu s minimální ztrátou pro následné analýzy. Cílem této práce je tedy nastavit standardní operační postup pro separaci klonálních plazmatických buněk MG a zkontrolovat kvalitu izolované DNA/RNA pro potenciální využití v následných analýzách. Během realizace této práce byly optimalizovány protokoly pro zamrazení/rozmrazení buněk pro rutinní využití v biobance. Hlavními kritérii pro optimalizaci byla vitalita vzorků po rozmrazení a cena materiálu. Také byl vytvořen a optimalizován protokol pro FACS separaci raritních populací klonálních plazmatických buněk, včetně intracelulárního barvení. Tento protokol a doporučené nastavení přístroje jsou připraveny k rutinním výzkumným účelům u mnohočetného myelomu, MGUS a AL amyloidózy. Z omezeného množství separovaných buněk byla současně izolována DNA a RNA. Navzdory nejednoznačné kontrole kvality může být tento protokol po menších úpravách využit v rutinní praxi.

Keywords

monoklonální gamapatie, sortování buněk, imunofenotypizace, kvalita DNA/RNA

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2015

Accessible from:: 27. 4. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 19. 5. 2015
• Supervisor: prof. MUDr. Roman Hájek, CSc.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology