Sekvenování nové generace jako nástroj identifikace nových rostlinných virů

Bc. Hana NOVOTNÁ

Master's thesis

High-throughput sequencing as a tool in identification of new plant viruses

Abstract:

Diplomová práce se věnuje charakterizaci nového nukleorhabdoviru infikujícího bez černý (Sambucus nigra) pomocí sekvenování nové generace a Sangerova sekvenování. Teoretická část popisuje metody vhodné pro identifikaci nových druhů virů se zaměřením na viry ovocných dřevin. Největší pozornost je věnována sekvenování nové generace. Je zde popsán princip sekvenování syntézou firmy Illumina, výhody a nevýhody využití různých typů templátových molekul, celkové RNA a DNA, siRNA, dsRNA a nukleových kyselin asociovaných s virionem. Dále se práce zabývá bioinformatickým zpracováním dat ze sekvenování nové generace, včetně trimování sekvencí, de novo skládání i mapování ´readů´ na referenční sekvenci, a identifikace získaných kontigů. V teoretické části jsou také popsány viry z čeledi Rhabdoviridae infikující rostliny, příznaky, které způsobují, morfologie jejich virionů a jejich molekulární charakteristika. Standardními technikami molekulární biologie a Sangerovým sekvenováním byla získána téměř úplná sekvence genomu viru z rodu Nucleorhabdovirus, který byl identifikován na bezu černém pomocí sekvenování nové generace. V jeho genomu bylo identifikováno šest otevřených čtecích rámců s organizací typickou pro viry z rodu Nucleorhabdovirus a konzervativní mezigenové sekvence. Byla provedena analýza identity celogenomové sekvence, plášťového proteinu, ´movement´ proteinu a RNA-dependentní RNA polymerázy a jejich genů u tohoto nového izolátu, ostatních virů z rodu Nucleorhabdovirus a typových zástupců dalších rodů z čeledi Rhabdoviridae infikujících rostliny. S nejpodobnějším virem má nový izolát ve všech analyzovaných nukleotidových sekvencích identitu lehce přesahující 50 %, a tak těsně nesplňuje kritérium pro uznání jako samostatný druh v rámci rodu Nucleorhabdovirus na základě sekvenční rozdílnosti. Lze jej ale považovat za samostatný druh na základě hostitelské specifity. Byla provedena fylogenetické analýza pro zjištění příbuznosti tohoto nového druhu s ostatními viry z rodu Nucleorhabdovirus.

Abstract:

This thesis focuses on characterization of a novel nucleorhabdovirus found in black elderberry (Sambucus nigra) identified by high-throughput sequencing. Theoretical part describes methods that enable discovering of novel virus species. It focuses on discovering viruses of fruit trees and shrubs. The biggest attention is given to high-throughput sequencing. It describes principles of Illumina sequencing by synthesis, advantages and disadvantages of using different template molecules, total RNA or DNA, siRNA, dsRNA or virion associated nucleic acid. Further, bioinformatic data processing is described including data trimmimg, de novo assembly and mapping reads against the reference sequence, and identification of obtained contigs. Theoretical part also focuses on characterization of viruses from family Rhabdoviridae infecting plants, symptoms they cause, virion morphology and their molecular characterization. Nearly complete genome sequence of novel virus from genus Nucleorhabdovirus identified on black elderberry by high-throughput sequencing was obtained by standard molecular technics and Sanger sequencing. Its genome comprises six open reading frames with typical organization of nucleorhabdoviruses and conservative intergenic sequences. Identities of genome sequence, nucleocapsid protein, movement protein and RNA-dependent RNA polymerase, and their genes were analyzed in novel isolate, other nucleorhabdoviruses and type species of other genera of plant rhabdoviruses. The most similar virus to the novel isolate shares the identity slightly exceeding 50 % which means it doesn´t fulfill species demarcation criteria based on sequence distance in genus Nucleorhabdovirus, but it can be considered a distinct species based on different ecology. The phylogenetic analysis was made to find out the congeniality of the new species to other viruses from genus Nucleorhabdovirus.

Keywords

Nucleorhabdovirus, bez černý, Illumina, viry ovocných dřevin, bioinformatická analýza

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 5. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 22. 6. 2020
• Supervisor: Mgr. Dana Šafářová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology