Vývoj a validace HPLC/MS a GC/MS metod ke stanovení vybraných opiátů

Bc. Lenka ŠIMEČKOVÁ

Master's thesis

Development and validation of HPLC/MS and GC/MS methods for determination of selected opiates

Abstract:

Opiáty jsou látky, jejichž účinky jsou srovnatelné s účinkem hlavního alkaloidu opia (pryskyřice z nezralých makovic máku setého) ? morfinu. Využívají se především díky svým tlumivým účinkům jako antitusika či jako analgetika při řešení různých bolestivých stavů. Ke stanovení byl vybrán morfin, kodein, dihydrokodein a oxykodon. V toxikologických laboratořích se využívají ke stanovení opiátů, díky svým velmi nízkým LOD a LOQ, především metody chromatografické ? HPLC či GC v tandemu s MS. Vývojem a validací metod HPLC/MS a GC/MS se zabývá tato práce. Optimalizace HPLC/MS (na systému Ultimate 3000/micrOTOF-QII) spočívala v nastavení složení a průtoku mobilní fáze (gradientová metoda), teploty kolony Kinetex C18 (25 °C) a nástřiku vzorku (30 ?l). U MS se nastavoval průtok (8 l/min), teplota sušícího plynu (230 °C) a tlak nebulizního plynu (2 bary), ionizace v pozitivním módu. U GC/MS metody (GC/MS Triple quad 7000) došlo ke změně derivatizačního činidla u morfinu a kodeinu (BSTFA + acetonitril), pro dihydrokodein a oxykodon byly metody vyvíjeny (nastavení optimální velikosti kolizní energie a detekční hmotnosti iontových fragmentů). Metoda pro oxykodon si vyžádala změnu předpřípravy vzorku z SPE na extrakci kapalnou fází s použitím elučních činidel: diethylether, octan ethylnatý a dichlormethan, jako derivatizační činidlo byl použit acetanhydrid a pyridin v poměru 3:2. Pro vybrané opiáty byly stanoveny LOD: 1?g/l a LOQ: 5 ?g/l. Pro morfin a kodein metodou GC/MS byly hodnoty vyšší: LOD 5 ?g/l, LOQ 10 ?g/l. Determinační koeficienty linearity jsou v rozmezí 0,993-0,999 a vykazují lineární závislost. Zbylé validační parametry: opakovatelnost, přesnost, mezidenní přesnost a správnost metod, mají odchylky do hodnoty ?10 % s pěti výjimkami ? opakovatelností oxykodonu, správností morfinu, kodeinu a mezidenní přesnosti morfinu a oxykodonu u GC/MS metody. Tyto odchylky byly detekovány pouze u koncentrací na úrovni LOQ, nejsou tedy příliš významné v toxikologických analýzách. Výsledky validace jasně ukázaly, že optimalizovaná HPLC/MS metoda i metoda GC/MS jsou vhodné ke stanovení vybraných opiátů vjejich terapeutických i toxických koncentracích. Optimalizované metody byly úspěšně otestovány na reálných vzorcích.

Abstract:

Opiates are substances, which has effect as main opium alkaloid (resin from unripe poppy head of Opium poppy) ? morphine. Their application is as analgesics and antitussives in various kinds of pain. Morphine, codeine, dihydrocodeine and oxycodone were chosen for determination. Thanks to low LOD and LOQ are chromatographic methods HPLC and GC in tandem with MS using in toxicological laboratory for determination of opiates. This thesis deals with development and validation HPLC/MS and GC/MS methods. Optimization of HPLC/MS (on Ultimate 3000/micrOTOF-QII system) were consist of setting the composition and flow of mobile phase (gradient method), column temperature Kinetex C18 (25 °C), sample injection (30 ?l). Flow (8 l/min), temperature (230 °C) of drying gas and pressure of nebulizing gas (2 bars) were setting on MS. Ionization was in positive mode. In GC/MS method (GC/MS Triple quad 7000) was changed derivatizing agent (for morphine and codeine), for dihydrocodeine and oxycodone were methods developed (setting the optimal size of collision energy and detecting mass of ion fragments). In method for oxycodone was necessary to change pre-preparation of sample ? instead of SPE, liquid phase extraction with eluent agent: diethyl ether, ethyl acetate and dichloromethane, derivatizing agent: acetanhydride and pyridine in a ratio 3:2. For chosen opiates were determined LOD: 1 ?g/l and LOQ: 5 ?g/l. LOD and LOQ for morphine and codeine in GC/MS method were higher (LOD: 5?g/l, LOQ: 10 ?g/l). The correlation coefficients of linearity are in the range of 0,993-0,999 and confirm linear dependence. The others parameters of validation: repeatability, precision, accuracy and interday precision, have deviation lower than ?10 %. Except: repeatability of oxycodone, accuracy of morphine, codeine and interday precision of morphine and oxycodone in GC/MS method. This deviation were detected only in LOQ concentration and are not important in toxicological analysis. Optimized HPLC/MS and GC/MS methods are suitable for determination of opiates in therapeutic and toxic concentration. Methods were successfully applied in real samples.

Keywords

opiáty, morfin, kodein, dihydrokodein, oxykodon, LC/MS, GC/MS, validace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2016

Accessible from:: 25. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Jiří Kalina, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry of Solid Phase