Určení struktury komplexu fosforylované tyrosin hydroxylasy se 14-3-3 proteinem

Bc. Katarína Monková

Master's thesis

Structure determination of phosphorylated tyrosine hydroxylase in complex with 14-3-3 protein

Abstract:

Tyrosin hydroxyláza katalyzuje hydroxylaci tyrosinu na L-DOPA a je rychlost-limitujícím krokem v biosyntéze katecholaminů. Produkty této reakce – dopamin, adrenalin a noradrenalin – fungují jako hormony a neurotransmitery a jejich vyvážené hodnoty jsou klíčové pro správnou funkci mozku. Regulace enzymové aktivity spočívá ve fosforylaci serinových reziduí na jeho N-terminálním konci a stabilizaci 14-3-3 proteiny. Cílem této práce bylo vyřešit strukturu celé dvojitě fosforylované lidské tyrosin hydroxylasy v komplexu se 14-3-3 proteinem pomocí kryo-elektronové mikroskopie. Diplomová práce představuje expresi, selektivní fosforylaci a purifikaci celé dvojitě fosforylované lidské tyrosin hydroxylasy isoformy 1, její interakční data se 14-3-3 ζ isoformou, stabilizační proceduru komplexu pomocí cross-linkingu a gradientové fixace. Tato vzorka byla podrobena negative stainingu, vitrifikovaná a data byla sesbíraná, 2D klasifikovaná a 3D model byl rekonstruován. Výzkum pokrývá purifikaci proteinu, přípravu kryoEM vzorku včetně jeho stabilizace, sběr dat a analýzu.

Abstract:

Tyrosine hydroxylase catalyses the hydroxylation of tyrosine to L-DOPA and is a rate-limiting step in catecholamine biosynthesis. The products of this pathway – dopamine, adrenaline, and noradrenaline – act as hormones and neurotransmitters and their balanced levels are crucial for the correct function of the brain. Regulation of the enzyme’s activity is carried out by phosphorylation of serine residues in its N-terminus, and stabilization by 14-3-3 proteins. This thesis aims to solve the structure of the double phosphorylated human tyrosine hydroxylase in complex with the 14-3-3 protein using cryo-electron microscopy. The thesis presents optimized expression, selective phosphorylation, and purification of double phosphorylated full-length human tyrosine hydroxylase isoform 1, its interaction data with the 14-3-3 ζ isoform, the stabilization procedure of the complex by cross-linking and gradient fixation. Such sample was subject to negative staining, vitrification and cryoEM data collection, 2D classification and 3D model reconstruction. The research covers protein purification, cryoEM sample preparation including its stabilization, data acquisition and analysis.

Keywords

purifikace, fosforylace, cross-linking, proteinový komplex, kryo-elektronová mikroskopie, purification, phosphorylation, protein complex, cryo-electron microscopy

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 6. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2021
• Supervisor: RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Reader: Mgr. Gabriel Demo, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biomolecular chemistry