Metody in vitro a in vivo pro hodnocení poškození DNA ve studiích lidského biomonitoringu

Bc. Anna Alaxinová

Diplomová práce

In vitro and in vivo methods for assessing DNA damage in human biomonitoring studies

Anotace:

Expozice genotoxickým sloučeninám v životním prostředí může mít škodlivé účinky na lidské zdraví. Průměrný člověk je každý den exponován celou řadou těchto stresorů, jako je sluneční UV záření, kontaminanty v potravinách nebo znečistěné ovzduší v kombinaci s možným vystavením dalším látkám v pracovním prostředí. Pouze přesným posouzením exposomu, který má významný vliv na genom, bude možné porozumět jejich vztahu a souvislosti s etiologií onemocnění. Použití molekulárních biomarkerů jako poškození nebo oprava DNA, představuje jednu možnost kvantifikace individuální expozice mutagenním látkám. Nízkonákladové biomarkerové testy jako kometový test (Comet assay) patří mezi často používané metody v studiích lidského biomonitoringu kvůli jeho citlivosti a všestrannosti. Tato práce popisuje výhody, doporučení pro optimalizaci a také diskuzi nevýhod při použití kometového testu v pilotní studii pracovní expozice 18 hasičů. Parametry DNA poškození (jedno- a dvou-řetězcové zlomy DNA a AP místa) a oxidativního poškození (převážně 8-oxo-Gua) byly hodnoceny na vzorcích izolovaných lymfocytů a plné krve pro každého účastníka studie. Výsledky neprokázaly neobvykle zvýšené hodnoty DNA poškození s výjimkou několika účastníků, což ukazuje, že hasiči jsou účinně chráněni před expozicí produktů hoření ochrannými prostředky. Dále byla kvantifikována reparační incizní aktivita u dalších dvou subjektů za použití in vitro testu na opravu DNA na bázi kometového testu za použití extraktů připravených z čerstvě izolovaných lymfocytů a zmrazených lymfocytů. Oba extrakty prokázaly zvýšenou reparační incizní aktivitu na substrátových buňkách vystavěných 15-minutové expozici UV(C) záření. Vyhodnocení všech výsledků bylo provedeno s využitím automatizovaného skenovacího systému Metafer, který výrazně snižuje čas potřebný pro kvantifikaci výsledků a zabraňuje subjektivnímu hodnocení komet. Výsledky ukazují, že jak kometový test tak in vitro test na bázi kometového testu pro hodnocení opravy DNA jsou citlivé a spolehlivé pro použití ve studiích lidského biomonitoringu, kde jsou potřebné finančně a časově efektivní metody pro rychlé zpracovaní a vyhodnocení lidských krevních vzorků.

Abstract:

Environmental exposure to genotoxic compounds can have deletrious effects on human health. Each day, an average person is exposed to several of these agents, such as sun light (UV radiation), food contaminants, air pollution in combination with possible occupational exposure to other substances. Only by precise assessment of the exposome which has a profound influence on the genome will it be possible to understand their relationship and connection to disease aetiology. Use of molecular biomarkers such as DNA damage or repair represents one possibility for quantification of individual exposure to mutagenic substances. Cost-effective biomarker assays, i.e. the comet assay belongs amongst usually employed methods in human biomonitoring studies due to its sensitivity and versatility. This work presents recommendations for optimization and common issues encountered by use of the comet assay in pilot study of occupational exposure of 18 fire fighters. Both DNA damage (strand breaks and AP sites) and oxidation levels (mainly 8-oxo-Gua) were assessed on samples of isolated lymphocytes and whole blood samples for each participant. The results did not show unusually elevated DNA damage values except for a few participants. which shows that fire fighters are effectively protected from exposure to combustion products by their clothing and additional equipment. Moreover, DNA repair incision activity was quantified for two additional subjects using the in vitro comet-based DNA repair assay in extract prepared from freshly isolated lymphocytes and frozen lymphocytes. Both extracts performed well in the assay and demonstrated elevated repair incision activity after 15-minute-long UV(C) exposure on substrate cells. Evaluation of results was performed using the automated Metafer slide-scanning system, which considerably decreases time period needed for result quantification and avoids subjective evaluation of comets. Results show that both comet assay and in vitro comet-based DNA repair assay are sensitive and reliable for use in biomonitoring studies, where cost and time-effective methods are needed for fast processing of human samples to avoid causing of additional damage.

Keywords

Biomarker, DNA poškození, DNA oprava, exposome, kometový test, Metafer, studie lidského biomonitoringu, SOS chromotest, comet assay, DNA damage, DNA repair, human biomonitoring studies

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 6. 2018
• Vedoucí: doc. RNDr. Pavel Čupr, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Anežka Sharma, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie