Příprava a analýza nových linií transgenního ječmene exprimujících rekombinantní antimikrobiální peptidy.

Mgr. Edita HOLÁSKOVÁ

Doctoral thesis

Generation and analysis of new transgenic barley lines expressing recombinant antimicrobial peptides.

Abstract:

An alarming increase in the emergence of antibiotic resistant strains of bacteria presents a severe problem at the global scale that requires an urgent action to avoid the so called post-antibiotic era, in which bacteria may became completely resistant to treatment, thus common infections could once again kill. Antimicrobial peptides (AMPs) LL-37, beta-defensin 2, and pexiganan, represent promising control agents to treat drug-resistant infections, as they target a wide spectrum of pathogens, including those of medical importance. Despite their therapeutic potential, the use of AMPs in medicine is limited, mainly due to their high production costs. In general, the use of plants for their production seems to be beneficial in this respect. However, certain technical limitations still remain. These are basically connected to potential toxicity of AMPs to the host plant, low accumulation levels and eventually also to the issues connected to product isolation and its biological activity. In an effort to address the above mentioned challenges, several fusion protein or peptide translocation, stabilization and purification sequences were selected and tested for their impact on accumulation level of LL-37 using transient expression in tobacco leaves. Results of this analysis provided valuable data that were taken into account when designing constructs for heterologous expression of LL-37 in barley. Next, stable transgenic fertile barley lines expressing various codon-optimized AMP fusion genes either under constitutive or selected grain specific promoter were generated and analysed. Although immunolabeling using specific antibodies confirmed on protein level the accumulation of all of the designed AMPs in barley grain endosperm, it was not possible to detect recombinant pexiganan and human beta-defensin 2 using Western blot. Contrary to that, heterologous expression of human LL-37 in barley grains yielded up to 0.55 ?g of recombinant peptide per gram of grain based on Western blot results. It was also shown that larger yields are achieved using a grain-specific than a constitutive promoter, that fusion of LL-37 to maltose-binding protein (MBP) increases its stability in desiccated grain and that cleavage of the LL-37 fusion protein using enterokinase results in efficient removal of the tags from recombinant products containing appropriate recognition sequence. Furthermore, the C- terminal KDEL extension in combination with N-terminal signal peptide resulted in accumulation of the product in endoplasmic-reticulum derived protein bodies that can be easily isolated for relatively low cost, which make this technology ideal for plant molecular farming with antimicrobial peptides. Finally, the recombinant LL-37 exhibited biological activity against E. coli TOP 10 cells either after cleavage of the tag in the case of MBP or even in a fusion with a smaller 6xHis tag or KDEL tetrapeptide.

Abstract:

Znepokojivý nárůst výskytu bakteriálních rezistentních kmenů představuje závažný problém v celosvětovém měřítku, který vyžaduje naléhavé řešení, aby nedošlo k tzv. post-antibiotické éře, kdy by rezistentní bakterie způsobující třeba i jinak "banální infekce" mohly mít opět na svědomí lidské životy. Antimikrobiální peptidy (AMPs) LL-37, beta-defensin 2 a pexiganan představují slibná činidla pro léčbu infekčních onemocnění způsobených rezistentními kmeny mikroorganismů, protože jsou aktivní vůči celé řadě patogenů včetně těch, jež si vyvinuly antibiotickou rezistenci. Navzdory jejich potenciálu je možnost praktického použití AMPs v medicíně limitována, a to především vysokou cenou spojenou s jejich produkcí. Z tohoto hlediska představuje využití rostlin pro jejich produkci velice slibnou strategii, která však vyžaduje řadu optimalizací. Ty jsou v zásadě spojeny s potenciální toxicitou AMPs vůči hostitelské rostlině, malým množstvím vyprodukovaného peptidu a případně také s problémy spojenými s izolací produktu a jeho biologickou aktivitou. Ve snaze vyřešit výše uvedená omezení bylo vyselektováno několik fúzních peptidických či proteinových translokačních, stabilizačních a purifikačních sekvencí a byl testován jejich vliv na množství LL-37 přechodně akumulovaného v listech tabáku. Výsledky této analýzy poskytly hodnotná data, která byla zohledněna při návrhu konstruktů pro heterologní expresi LL-37 v ječmeni. Následně byly metodou stabilní transformace připraveny a analyzovány fertilní linie ječmene exprimující buď pod konstitutivním, anebo vybraným zrnově specifickým promotorem různé varianty fúzních AMP genů podrobených kodonové optimalizaci pro ječmen. Přestože byla na proteinové úrovni metodou imunolokalizace s využitím specifických protilátek potvrzena přítomnost všech navržených AMPs v endospermu ječmenného zrna, nebylo možné metodou Western blotu detekovat rekombinantní pexiganan ani lidský beta-defensin 2. Naproti tomu Western blot analýza transgenních zrn ječmene exprimujících lidský LL-37 potvrdila akumulaci peptidu, která dosahovala hodnoty až 0.55 ug rekombinantního peptidu na gram zrna. Bylo prokázáno, že použití zrnově specifického promotoru je spojeno s dosažením větších výtěžků, než je tomu v případě konstitutivního promotoru, dále že fúze LL-37 k proteinu maltózu-vázajícímu (MBP) zvyšuje jeho stabilitu v desikovaném zrnu a že použití enterokinázy vede k účinnému odstranění značek z rekombinantních fúzních LL-37 produktů obsahujících příslušnou rozpoznávací sekvenci. Kromě toho přítomnost C-terminální KDEL sekvence v kombinaci s vhodným N-koncovým signálním peptidem vedla k akumulaci produktu v proteinových tělískách odvozených od endoplazmatického retikula, které lze snadno izolovat při relativně nízkých nákladech, což činí tuto technologii ideální pro produkci antimikrobiálních peptidů pomocí rostlinného molekulárního farmaření. Závěrem byla prokázána biologická aktivita rekombinantního LL-37 vůči E. coli TOP 10 buňkám, a to buď po odštěpení fúzního proteinu v případě MBP, anebo dokonce ve fúzi s menší 6xHis kotvou nebo KDEL tetrapeptidem.

Keywords

antimikrobiální peptidy, biotesty, klonování, strategie genové exprese, genetická modifikace, zrnově specifické promotory, Hordeum vulgare, lidský beta-defensin 2, LL-37, Nicotiana benthamiana, pexiganan, rostlinné molekulární farmaření, detekce rekombinantních produktů

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 10. 2019

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry