Změny proteomu révy vinné vyvolané stresovými faktory

Bc. Barbora Kurková

Master's thesis

Changes in Vitis vinifera proteome triggered by stress factors

Abstract:

U révy vinné dochází během obranné reakce ke zvýšení exprese proteinů, které se podílejí na aktivní obraně vůči patogenům. Je obecně známo, že biotický i abiotický stres zvyšují expresi pathogenesis-related (PR) proteinů. Změny v expresi i aktivitě PR proteinů (chitinas, glukanas a thaumatin-like proteinů) byly u révy vinné (Vitis vinifera L.) pozorovány po působení abiotického stresu i po napadení houbovými patogeny. Cílem diplomové práce bylo porovnání kvalitativních a kvantitativních změn v extracelulárním a intracelulárním proteomu suspenzní kultury Vitis vinifera v odpovědi na působení biotického a abiotických stresových faktorů. Suspenzní kultury révy vinné (Vitis vinifera cv. Gamay), které byly podrobeny působení biotického stresového faktoru v podobě patogenu Botrytis cinerea (Plíseň šedá) a abiotickým stresovým faktorům ve formě mechanického poškození a teplotního šoku. Pro separaci intracelulárního proteomu byly optimalizovány podmínky 2D elektroforézy na fokusačních stripech s imobilizovaným gradientem pI 3-11 NL s následnou SDS PAGE v 12 % gelu a barvením pomocí barviva SYPRO RUBY. V případě extracelulárních proteinů bylo médium zkoncentrováno na cut-off kolonce a následně analyzováno pomocí LC-MS/MS analýzy. Na jednotlivých gelech bylo pomocí softwaru PDQuest identifikováno přibližně 450 spotů, kdy mezi kontrolou a biotickým stresem bylo nalezeno 34 spotů se signifikantně rozdílnou expresí a mezi kontrolou a mechanickým stresem 20 spotů se signifikantně rozdílnou expresí. Celkem 20 spotů se podařilo úspěšně identifikovat pomocí LC-MS/MS metody, kdy většina identifikovaných proteinů již byla dříve popsána v souvislosti s obrannou reakcí. U extracelulárního proteomu v současné době probíhá optimalizace derivatizace proteinů a jejich analýzy pomocí LC-MS/MS metody.

Abstract:

Within the defense reaction of grapevine, the expression of proteins playing role in an active defence against pathogens is enhanced. It´s generally known that biotic and abiotic stresses induce the expression of pathogenesis-related (PR) proteins. Changes in the expression and activity of PR proteins (chitinases, glucanases and thaumatin-like proteins) have been reported in grapevine (Vitis vinifera L.) after exposure to abiotic stress and attack by fungal pathogens. The aim of this study was to compare the qualitative and quantitative changes in the extracellular and intracellular proteom of suspension culture of Vitis vinifera in response to the action of biotic and abiotic stress factors. The cell suspensions of grapevine (Vitis vinifera cv. Gamay) were subjected to biotic stress factor using pathogen B. cinerea (gray mold) and abiotic stress factors using mechanical damage and thermal shock. The conditions of 2D electrophoresis were optimized for the separation of intracellular proteome. Immobilized pH gradient gel strips (pI 3-11 NL) were used followed by SDS PAGE in 12% acrylamide gel and they were stained by SYPRO RUBY stain. Extracellular proteins in the culture media were concentrated using 3 kDa membrane and subsequently analyzed using LC-MS/MS analysis. At the individual gels were identified approximately 450 spots using software PDQuest when 34 spots significantly differed between the gel of the control sample and the gel of the sample after exposure to biotic stress. Further 20 spots were significantly differed between the gel of the control sample and the gel of the sample after exposure to mechanical stress. Consequently 20 spots were successfully identified by LC-MS/MS method when the most of the identified proteins have been previously described in relation to defence reaction in plants. Today, derivatization and analysis of the extracellular proteins by LC-MS/MS method is being optimized.

Keywords

abiotické a biotické stresové faktory, abiotic and biotic stress factors, obranná reakce, plant defence, Vitis vinifera cv. Gamay, proteiny spojené s patogenezí, pathogenesis-related proteins, proteom, elektroforéza, electrophoresis, kyselina salicylová, salicylic acid

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Jan Lochman, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry