Tkáňová lokalizace vybraných proteinů Eudiplozoon nipponicum (Monogenea)

Bc. Gabriela Sajlerová

Diplomová práce

Tissue localization of selected proteins from Eudiplozoon nipponicum (Monogenea)

Anotace:

Monogenea patří mezi parazitické ploštěnce (Platyhelminthes), kteří cizopasí především na vnějších částech těla ryb, jako jsou ploutve, žábra a kůže. Živí se zejména mukusem, tkáňovým detritem nebo krví hostitele. Podobně jako jiní parazité, také Monogenea produkují velké množství molekul (zejména proteinů), které jim umožňují přichytit se na hostiteli, přijímat potravu a tlumit či jinak modifikovat imunitní odpověď hostitele. Mezi proteiny vylučované parazity patří také inhibitory cysteinových a serinových proteáz (cystatiny a serpiny), které interagují s příslušnými proteázami hostitele. Lokalizace těchto důležitých molekul v těle parazita může přiblížit jejich funkci. Detailní charakterizace, lokalizace či popis funkce proteinů produkovaných zástupci monogeneí v současné době významně zaostává za znalostmi o proteinech jiných skupin helmintů. V této diplomové práci jsme ověřovali funkčnost protilátek (jejich reaktivitu) z myší imunizovaných rEnSerp (rekombinantní serpin Eudiplozoon nipponicum (Goto, 1891) a králíků imunizovaných rEnCys (rekombinantní cystatin E. nipponicum). Sledována byla reakce s rEnSerp, rEnCys a homogenátem dospělců krev sajícího parazita E. nipponicum (Monogenea) metodou dot blot, western blot a ELISA. S využitím totožných protilátek jsme se zmíněné proteiny našeho zájmu (serpin a cystatin) pokusili lokalizovat také ve tkáních E. nipponicum pomocí nepřímého imunohistochemického barvení. V těchto experimentech byly primární protilátky proti rEnSerp a rEnCys kombinovány s enzymaticky či fluorescenčně značenými sekundárními protilátkami. Za účelem amplifikace signálu jsme použili LSAB metodu (labeled streptavidin binding method). Byla potvrzena reaktivita protilátek s cílovými antigeny rekombinantních proteinů (rEnSerp a rEnCys). Reaktivita protilátek proti serpinu v homogenátu nebyla prokázána. Reaktivita protilátek proti cystatinu v homogenátu byla potvrzena, ale preimunní sérum vykazovalo silné nespecifické reakce. Pozitivní imunoznačení serpinu nebylo v tkáni prokázáno. Pozitivní imunoznačení cystatinu je pravděpodobně lokalizováno v somatických buňkách (parenchymu) E. nipponicum.

Abstract:

Monogenea are parasitic organism (Platyhelminthes), which reside mainly on the outer parts of the body of fish, such as fins, gills and skin. They feed particularly by mucus, tissue detritus or host blood. Like other parasites, species of Monogenea also produces a large number of molecules (especially proteins) that allow them to attach to the host, eat and inhibit or modify the host's immune responses. Parasite secreted proteins include inhibitors of cysteine and serine proteases (cystatins and serpins) that interact with host proteases. Localization of these important molecules in the body of the parasite can approximate details about their function. The characterization, localization or description of the function of the proteins produced by Monogenea currently significantly lags behind the knowledge of the proteins of other groups of helminths. In this diploma thesis we have verified the reactivity of the antibodies from mice immunized rEnSerp (recombinant Eudiplozoon nipponicum serpin) and from rabbit immunized rEnCys (recombinant E. nipponicum cystatin). The reactivity of rEnSerp, rEnCys and homogenate of adult blood-feeding parasite E. nipponicum (Monogenea) was tested by dot blot, Western blot and ELISA. By using the same antibodies, we have localized proteins of interest (serpin and cystatin) by indirect immunohistochemical staining. In these experiments, primary antibodies against rEnSerp and rEnCys was combine with enzymatically or fluorescently labeled secondary antibodies to detect the antigens of adult worm on paraffin sections and cryo sections. We used the LSAB method (labeled streptavidin binding method) to amplify the signal. The reactivity of the antibodies with target antigens of recombinant proteins (rEnSerp and rEnCys) has been confirmed. The reactivity of antibodies against serpin in the homogenate has not been confirmed. The reactivity of antibodies against cystatin in the homogenate was confirmed, but the preimmune serum had strong non-specific reactions. Positive serpin immunostainning was not proven in the tissue. Positive immunostaining of cystatin is probably localized in somatic cells (parenchyma) of E. nipponicum.

Klíčová slova

serpin, cystatin, Eudiplozoon nipponicum, Monogenea, imunohistochemie, lokalizace, proteiny, interakce mezi parazitem a hostitelem, immunohistochemistry, localization, proteins, interactions between the parasite and the host

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 1. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 2. 2019
• Vedoucí: RNDr. Martin Kašný, Ph.D.
• Oponent: RNDr. Šárka Mašová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Ekologická a evoluční biologie / Zoologie