Chemická derivatizace proteinů a peptidů pro usnadnění jejich de novo sekvenace

Bc. Denisa Suchánková

Diplomová práce

Chemical derivatization of proteins and peptides for facilitating their de novo sequencing

Anotace:

Předložená diplomová práce se zabývá technikami úpravy proteomického vzorku pro snadnější interpretaci tandemových hmotnostních spekter za účelem de novo sekvenace proteinů. V experimentální části byly provedeny modifikační reakce tryptických peptidů myoglobinu. Na stacionární fázi v kolonce (s následující separací) byly provedeny reakce s O-methylisomočovinou a 4-sulfofenylisothiokyanátem, dále dimethylace formaldehydem (lehkým a deuterovaným). V roztoku byla provedena reakce s 4-chlorosulfofenylisothiokyanátem a esterifikace peptidických karboxylů ethanolem. Jako efektivní metody se ukázaly být oba typy modifikačních reakcí prováděných na kolonce. Modifikace O-methylisomočovinou a 4-sulfofenylisothiokyanátem poskytovala přehledná fragmentační spektra obsahující y-ionty, což spolu s protokolem pro aplikaci obohacení peptidů obsahujících sulfonové skupiny usnadňuje hmotnostně spektrometrickou analýzu složitějších směsí. Podobně dimethylace peptidů pomocí formaldehydu po jejich předchozí guadinylaci umožnila identifikovat N-terminální ionty pomocí dvojic píků s konstantním rozdílem a usnadnit tak interpretaci MS/MS spekter peptidů.

Abstract:

Presented diploma thesis deals with sample modification techniques for facilitated interpretation of tandem mass spectra during de novo sequencing of proteins. In the experimental part, the modification reactions of tryptic peptides from equine myoglobin were carried out. Modification with O-methylisourea hemisulfate, sodium 4-sulfophenylisothiocyanate and dimethylation with light and heavy formaldehyde were carried out on the stationary phase inside a chromatography column with the optional following separation of modified peptides. Modifications with 4-chlorosulfophenylisocyanate and esterification of peptide carboxyl groups with ethanol were carried out on the stationary phase dispensed in solution. Modification with O-methylisourea hemisulfate and sodium 4-sulfophenylisothicyanate yielded with MS/MS spectrum only with y-ions, which facilitates mass spectrometry analysis of more complex samples especially in combination with a protocol for enrichment of peptides containing sulfonic group. Similarly, peptide dimethylation with formaldehyde after preceding guanidylation reaction, enabled also identification of N-terminal ions due to the presences of peak pairs showing a constant difference and thus facilitated interpretation of MS/MS spectrum of fragmented peptides.

Klíčová slova

De novo sekvenace, chemická derivatizace, hmotnostní spektrometrie, MALDI-TOF/TOF MS

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2017
• Vedoucí: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů