Embryonální vývoj a transplantace primordiálních zárodečných buněk u candáta obecného Sander lucioperca

MSc. Hilal GÜRALP

Doctoral thesis

Embryo development and transplantation of primordial germ cells in pikeperch Sander lucioperca

Abstract:

It is the purpose of this thesis to implement primordial germ cell (PGC) transplantation, one of the new biotechnological reproductive methods, and for this to explain the details that we have to know about embryo development and PGC migration in pikeperch. We provide several specific useful methods such as GFP labelling and blastodisc surgery which are required for efficiency assessment of the transplantation technique. The main results of the publications in the thesis could be informative and useful for generation of germline chimera by using pikeperch. We described pikeperch embryo development to first feeding at 15°C in detail and demonstrated effects of temperature on the rate of embryogenesis to determine temperature limits for slowing development with minimum negative effects on growth and survival rate. We also developed a technique to soften the pikeperch chorion by enzyme in order to remove it by forceps for in depth observation. Additional groups of eggs were fertilised and incubated at different temperatures to document embryo developmental stages, developmental rate, and survival. The optimum fertilisation and incubation temperature was 15°C, with the highest fertilisation, survival, and hatching rates. Embryo development was drastically slowed down at 10 °C, with 45% of fertilised embryos surviving to hatching. Development was accelerated at 20 °C, with a 56% survival rate of fertilised embryos. After the series of experiments to characterize the embryo development of pikeperch, it could be a valuable model percid for research in which flexible incubation temperatures is required. We described the important early embryonic events, namely, yolk syncytial layer (YSL) formation and midblastula transition (MBT) during the blastula stage in pikeperch embryos. The chorion was removed as we described in the first study. The YSL was formed after the breakdown of marginal cells during the 512- to 1k-cell stage. Cell division analysis by 4'-6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) staining revealed that transition from synchronous to asynchronous division occurred after 1k-cell stage. Our results indicate that MBT starts after this stage. Next, we performed blastodisc isolation assay to find the competent stage for embryonic manipulation. Embryos were manipulated by using a microneedle every hour from the 512-cell to the sphere stage, and then developmental rates were evaluated at the hatching stage. The highest survival rate was obtained when we performed this manipulation at the 1k-cell stage. These results clearly showed that the MBT is the best stage for transplantation of PGCs or any cells in pikeperch. We described PGC migration and performed blastomere transplantation in pikeperch. PGCs were visualised by injection of synthesised green fluorescent protein (GFP) within the 3'untranslated region (UTR) mRNA of nanos3. GFP-positive PGCs appeared in all embryos at approximately 100% epiboly. Time-lapse imaging revealed the PGC migration pattern from their initial appearance to the location at the gonadal ridge. We conducted blastomere transplantation at the blastula stage. Donor embryos were labelled with GFP-nos3 3'UTR mRNA and tetramethylrhodamine dextran to label PGCs and somatic cells, respectively. Twelve blastomere transplantation chimeras were produced, with eight surviving to hatching. All exhibited donor-derived somatic cells in the developing body. The PGCs from donor embryos were observed to migrate towards the gonad region of the host embryos. Our results indicated that blastomere transplantation can be successfully applied in pikeperch, and these findings may be useful to produce germline chimeras in percids.

Abstract:

Cílem této práce bylo popsat embryonální vývoj a migraci primordiálních zárodečných buněk neboli primordiálních gonocytů (PGC) a realizovat transplantaci PGC u candáta obecného. V práci popisuji několik specifických metod, jako je GFP značení a mikromanipulace s blastodiskem, které jsou nutné pro posouzení účinnosti transplantační techniky. Hlavní výsledky této práce mohou být využity pro vytvoření chimér zárodečné linie candáta obecného. Detailně jsme popsali embryonální vývoj candáta obecného až do prvního krmení při 15 °C a efekt teploty na rychlost embryogeneze při stanovení teplotních limit pro zpomalení vývoje a to s minimálními negativními důsledky na růst a míru přežití. Také jsme vyvinuli techniku změkčení chorionu candáta obecného díky použití enzymy za účelem snadného odstranění chorionu pomocí pinzet, což umožňuje detailnější pozorování. Navíc byla skupina jiker oplozena a inkubována v rozdílných teplotách za účelem zdokumentování vývojových stádií embrya, rychlosti vývoje a míry přežití. Optimální inkubační teplota, s nejvyšším oplozením, mírou přežití a mírou vykulení, byla 15°C. Embryonální vývoj byl významně zpomalen při 10 °C, s 45 % vykulených embryí (počítáno z oplozených jiker). Vývoj byl zrychlený při 20 °C, s 56 % mírou přežití oplozených embryí. Po sérii experimentů, charakterizujících embryonální vývoj candáta obecného, jsme dospěli k závěru, že pro výzkum, kde jsou požadovány flexibilní inkubační teploty, může být candát obecný z čeledi okounovitých hodnotným modelem. Popsali jsme důležité fáze časné embryogeneze, konkrétně formování žloutkové syncytiální vrstvy (YSL) a přechod midblastuly (MBT) během stádia blastuly embryí candáta. Chorion byl odstraněn způsobem popsaným v první studii. YSL se formovalo po rozpadu marginálních buněk během stádia 512 - 1 000 buněk. Následná analýza buněčného dělení pomocí barvení 4'-6'-diaminido-2-phenylindole (DAPI) ukázala, že přechod ze synchronního k asynchronnímu dělení se vyskytuje po desátém rýhování, ve stádiu 1000 buněk. Naše výsledky naznačují, že fáze MBT nastává až po tomto stádiu. Dále jsme provedli test isolace blastodisku, za účelem nalezení kompetentního stádia pro následnou embryonální manipulaci. S embryi bylo manipulováno za použití mikrojehly a mikromanipulátoru. Každou hodinu od stádia 512 buněk do stádia "sphere stage". Poté byly vyhodnoceny vývojové rychlosti ve stádiu kulení. Nejvyšší míra přežití byla získána, když provádíme tuto manipulaci v 1k-buněčné. Výsledky jasně ukazují, že embryo ve fázi MBT je nejvhodnější pro transplantaci PGC, nebo jinou manipulaci, u candáta obecného. Popsali jsme migraci PGC a provedli jsme transplantaci blastomer candáta obecného. PGC byly vizualizovány díky injikaci uměle syntetizované mRNA GFP-nos3 3'UTR. GFP-positivní PGC se objevily ve všech embryích ve stádiu přibližně 100% epiboly. Pomocí časosběrného snímání jsme popsali migrační vzor PGC od jejich počátečního objevení až po lokaci v zárodečné rýze. Během stádia blastuly jsme provedli transplantaci blastomer. Embrya donora byla značena pomocí GFP-nos3 3'UT mRNA a tetramethylrhodamine dextran pro značení PGC a somatických buněk. Vzniklo tak 12 chimér vyniklých transplantací blastomér, z nichž 8 se dožilo kulení. Ve vyvíjejících chimérách byly zřetelné dále se vyvíjející PGC a somatické buňky pocházející od donora. Transplantované PGC byly pozorovány během migrace až do usídlení v zárodečné rýze recipienta. Naše výsledky ukazují, že transplantace blastomér může být úspěšně aplikována u candáta obecného a naše výsledky mohou být užitečné pro produkci chimér zárodečné linie u okounovit

Keywords

embryogenezi, candát, chimérická zárodečná linie, izolace blastodisku, migrace primárních zárodečných buněk, přechod midblastuly, vizualizace primárních zárodečných buněk, teplotní tolerance, transplantace blastomérů

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 9. 2017

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery