Mikromanipulace a kryopreservace zárodečných buněk ryb

Mgr. Zuzana LINHARTOVÁ

Doctoral thesis

Micromanipulation and cryopreservation of germ cells in fish

Abstract:

Vytváření chimér zárodečných linií je v současné době jedním z poutavých témat výzkumu v oblasti rybářství. Tato metoda má potenciál zabezpečit nebo zvýšit produkci gamet druhů, které jsou komerčně velmi cenněné, ohrožené nebo druhů s problematickou reprodukcí a to za použití běžně dostupného druhu přizpůsobeného k umělému výtěru jako producenta těchto gamet. Hlavním cílem této technologie je získání generačních ryb malých rozměrů (host) produkující reprodukčně funkční gamety druhu původního (donora) po transplantaci zárodečných kmenových buněk donora do hosta. Klíčovými faktory pro vytvoření této biotechnologie je velké množství předběžných experimentů: dokumentace embryonálního a larválního vývoje donora i hosta, charakterizace zárodečných kmenových buněk společně s dokumentací jejich migračních aktivit, sterilizace hosta, izolace a kryoprezervace zárodečných buněk donora. Všechny tyto pokusy byly hlavním cílem této práce. V této práci jsme se zabývali dvěma odlišnými taxonomickými skupinami ryb. Nejprve naší hospodářsky využívanou rybou, línem obecným, kde bychom chtěli uplatnit své dosažené znalosti k vytvoření chiméry zárodečné linie u kaprovitých ryb za pomocí transplantace zárodečných buněk lína (donora) do menšího a rychleji se rozmnožujícího druhu, kterým je kardinálka čínská. Dále jsme se zaměřili na jesetery, skupinu ryb zahrnující celou řadu ohrožených druhů (evidovaných v Červené knize ohrožených druhů (IUCN)), ryby dosahujících velkých rozměrů a zpravidla s dlouhým reprodukčním cyklem. V tomto případě jsme si vybrali jesetera malého jako hosta kvůli kratšímu reprodukčnímu intervalu a menší velikosti těla, k produkci gamet donora, kriticky ohroženého druhu s dlouhým reprodukčním cyklem, jakým je vyza velká. Touto inovativní technologiií bychom mohli získat spermie a jikry v kratším časovém intervalu a od menšího druhu. V případě lína obecného, jsme se nejprve zaměřili na dokumentaci jeho embryonálního a larválního vývoje společně s popisem původu a migračních aktivit primordiálních zárodečných buněk (PGCs). Tyto buňky byly vybrány jako vhodný prostředek pro vytvoření chiméry zárodečné linie v rámci druhu, jelikož nesou genetickou informaci obou rodičů a jsou schopné samovolně migrovat do míst výskytu budoucích gonád (Linhartova a kol., 2014a). Poté jsme vyvinuli praktické metody pro izolaci a kryopreservaci pozdějších vývojových stádií kmenových zárodečných buněk (GC), spermatogonií (SG) a spermatocytů (Linhartova a kol., 2014b). V případě jeseterovitých ryb, Saito a kol. (2014) popsal migrační aktivitu i samotný původ PGCs, který se soustředuje do vegetativního pólu jikry, stejně jako je to známo u obojživelníků. Dále Pšenička a kol. (2015) popsal izolaci a kryopreservaci GC, zastoupených převážně SG a OG a previtellogeními oocyty, 2-4 letých jeseterů sibiřských. Izolované GC byly transplantovány do hosta (jesetera malého) a úspěšně kolonizovaly jeho zárodečnou rýhu. Na závěr jsme se zabývali sterilizací hosta, jesetera malého, potenciálního hosta pro transplantaci zárodečných buněk donora. Snahou bylo dosáhnout sterility pomocí knockdownu specifického genu zárodečných buněk látkou morfolino antisense oligonukleotid (MO) dndMO. Naše výsledky popisují první spolehlivě fungující způsob sterilizace jeseterovitých ryb (Linhartova et al., manuskript). Navíc jsme publikovali důležité informace o morfologii a ultrastruktuře spermií vyzy velké pomocí skenovací a transmisní elektronové mikroskopie, rozšiřující znalosti o stavbě spermií a týkající se i evolučních a taxonomických vztahů mezi jesetery (Linhartova et al., 2013). Tato práce představuje několik studií s odlišn

Abstract:

The induction of germ-line chimerism is an expanding focus of fisheries research. This technique is having a potential to enhance the production of gametes of species that are commercially valuable, endangered, species with problematic reproduction, using a more common or easily available species or species adapted to artificial reproduction as a surrogate host. The main goal of this technology is to establish a small-bodied surrogate broodstock producing functional donor gametes based on germ cell transplantation. Extent preliminary experiments, including documentation of donor/host embryonic and larval development, characterization of germ cells enriched by documentation of their migratory activities, sterilization of the host, isolation and cryopreservation of donor germ cells, are key factors for launching this biotechnology. All these crucial points were the main objective of the present work. The whole thesis provided the focus on two different fish species. First, our commercially valuable fish, the tench, where we would like to apply our current knowledge to create a germ-line chimera within cyprinids by transplantation of tench germ cells to smaller and faster-reproducing fish species as white cloud mountain minnow. Secondly we focused on the endangered species (listed in IUCN Red List) of large body size with long reproductive cycle, the sturgeons. In this case, we have chosen sterlet as a host, providing an advantage of shorter generation interval and smaller body size, to produce gametes of donor, a critically endangered species of large body size with long reproductive cycle, such as beluga. This innovative technology could result in collection of sperm and eggs in shorter time from small-bodied host. In tench we firstly focused on embryonic and larval development documentation together with description of origin and migration pathways of primordial germ cells (PGCs). PGCs represent a powerful tool for creation a germ-line chimera within fish species because they transmit genetic information to the next generation (Linhartova et al., 2014a). Secondly, we reported a practical technique for isolation and cryopreservation of early stages of germ cells (GC), including spermatogonia (SG) and spermatocytes (Linhartova et al., 2014b). In case of sturgeons, Saito et al. (2014) firstly described the origin and migration patterns of sturgeon PGCs deposited at the vegetal pole of the egg similar to that in anurans. Secondly, Psenicka et al. (2015) reported isolation and cryopreservation of female and male GC, SG from testes and OG and pre-vitellogenic oocytes from ovary, of 2-4-year old Siberian sturgeon. Moreover the isolated GC were transplanted into host (sterlet) and process of transplantation resulted in successful colonization of sterlet genital ridge. The potential host for germ-cell tranplantation, sterlet, was sterilized by knock-down of germ cell specific gene, the dead end gene, by the morpholino antisense oligonucleotide (MO) agent (dnd-MO). These results reported the first known and functional method of sturgeon sterilization (Linhartova et al., manuscript). We provided important information on morphology and ultrastructure of beluga spermatozoa structure by scanning and transmission electron microscopy to increase knowledge of evolutionary and taxonomic relationships among sturgeons (Linhartova et al., 2013). Finally, this thesis presents several studies with differing focus of research but with one target goal to induce germ-line chimerism in fish. All these results are prerequisite of future application and development of surrogate production in these species.

Abstract:

ými zaměřeními, ale s jedním hlavním cílem - vytvoření chimér zárodečných linií u ryb. Všechny tyto výsledky jsou předpokladem pro budoucí aplikaci této technologie.

Keywords

jester, lín obecný, zárodečné buňky, sterilizace, kryopreservace, transplantace, chiméra zárodečné linie, dead end gen

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 9. 2015

Zverejniť od: 3. 9. 2015

Obhajoba závěrečné práce

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / odbor:
Zootechnics / Fishery